MicroRNA-31在肝癌中的腫瘤抑制作用

木 蘭 托 婭

(內蒙古醫科大學基礎醫學院寄生蟲學教研室，內蒙古 呼和浩特 010059)

?

MicroRNA-31在肝癌中的腫瘤抑制作用

木 蘭 托 婭1

(內蒙古醫科大學基礎醫學院寄生蟲學教研室，內蒙古 呼和浩特 010059)

目的 分析微小RNA-31(MicroRNA-31)在肝癌中的腫瘤抑制作用和影響機制。方法 選取2014年6月至2016年1月收治的HBV感染者為研究對象，依照患者病情分為急性肝炎組、慢性肝炎組、肝硬化組、肝癌組，另外選取同期健康體檢人員30例作為健康組，采集患者外周靜脈血，測定MicroRNA-31表達情況。肝癌手術患者留取肝癌組織和癌旁正常組織，細胞轉染，實施平板克隆形成實驗。選取健康裸鼠，在無菌條件正常飲食下，將轉染肝癌組織經皮下注射置入裸鼠，3 w后處死，取出腫瘤組織，測量體積。同時開展Western印跡，采用實時熒光RNA和免疫組織化學法測定觀察。結果 感染HBV后，細胞MicroRNA-31存在高表達情況，肝癌組患者組織核細胞MicroRNA-31表達顯著高于其他組(P<0.05)。平板克隆實驗測定，轉染MicroRNA-31的腫瘤細胞克隆數增殖減少50%(P<0.05)。體外成瘤實驗，轉染MicroRNA-31后的肝癌細胞成瘤能力下降，而且腫瘤體積縮小。Western印跡檢測，細胞轉染后，LATS2表達水平提高1.5倍，PPP2R2A表達無明顯變化，轉染LATS2siRNA細胞中LATS2表達顯著下降(P<0.05)。MicroRNA-31表達與LATS2呈現負相關(P<0.05)。免疫組織化學法檢測顯示，肝癌組織中LATS2表達水平顯著低于正常組織。 結論 肝癌組織中MicroRNA-31可能通過調節LATS2抑制腫瘤增殖，MicroRNA有望成為分子指標靶向藥物。

肝癌；微小RNA-31;腫瘤抑制；熒光定量RNA

乙型肝炎病毒(HBV)感染與肝癌發生發展有關。HBV感染疾病中，微小(Micro)RNA能夠參與調節作用。MicroRNA屬于比較保守的單鏈非編碼RNA，能夠與靶基因結合〔1〕，調控轉錄基因的表達，參與多種生理過程，發揮抑癌基因或者癌基因作用。當前研究發現半數以上的MicroRNA基因固定在腫瘤基因相關區域，并且腫瘤發生發展中，常出現異常表達。MicroRNA-31最早在Hela細胞中被發現，位于染色體9P21.3。MicroRNA-31短鏈非編碼RNA長度為18～25個核苷酸〔2〕。當前研究發現MicroRNA-31能夠參與多種生物學作用，如細胞增殖、分化、凋亡，很多研究指出MicroRNA-31能夠參與肺癌、食管癌等疾病發生進展，不同惡性腫瘤中MicroRNA-31發揮作用的研究結果也不一致〔3〕。本研究重點分析MicroRNA-31在肝癌中的抑制作用和影響機制。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2014年6月至2016年1月收治的HBV感染者。納入標準：均符合急慢性HBV感染納入標準；排除標準：化療、其他肝臟疾病、妊娠期、嚴重肝腎衰竭等患者。依照患者病情分為急性肝炎組、慢性肝炎組、肝硬化組、肝癌組。急性肝炎組30例中男19例，女11例；年齡34～63歲，平均(45.3±7.5)歲。慢性肝炎組29例中男18例，女11例；年齡36～69歲，平均(48.2±10.3)歲。肝硬化28例中男16例，女12例；年齡31～62歲，平均(46.3±8.5)歲。肝癌組32例中男22例，女10例；年齡34～68歲，平均(48.3±9.7)歲。另外選取同期來我院健康體檢人員30例作為健康組，男18例，女12例；年齡32～68歲，平均(46.2±9.8)歲。5組患者一般資料具有可比性(P>0.05)。

主要試劑：RNA提取試劑盒(上海巖鑫生物科技有限公司)、RNA酶抑制劑(上海禾興生物科技有限公司)、RNA-DNA嵌合探針(上海吉瑪生物公司)、Trizol(大連寶生物有限公司)、探針序列(上海生工生物有限公司)、微球捕捉序列(Bio-Rad)、DMEM(Gibco公司)、抗體(Abcam公司)、RNA試劑盒(Qiagen公司)、反轉錄酶(Fermentas公司)。

主要儀器：PCR儀器(Bio-Rad)、Luminex液態芯片分析系統(Luminex)、紫外分光光度計(上海儀電分析儀)、離心機(Termo)。

1.2 方法 采集患者外周靜脈血5 ml，加入Ficoll提取液，離心，吸出灰色外周血單個核細胞(PBMC)。在PBMC中加入Trizol共1 ml，反復吹打，嚴格按照說明書抽取總RNA，采用分光光度法測定吸光度。當A260/A280比值1.9～2.1時，加入RNA酶抑制劑。采用RNA-DNA嵌合探針液態芯片檢測MicroRNA-31表達情況。實驗中用到的探針序列采用Oligo6.0軟件設計，由生物工程公司合成，登錄號：407035。RNA-DNA嵌合探針序列：AGC AUG CCA GCA AGC AUC UUG CUC CGC CGT TGT CCT GTC；微球捕捉DNA序列：GAC AGG ACA ACG GCG G。檢測時，取3次熒光信號平均讀數作為有效數值。

肝癌患者采取手術治療，留取肝癌組織和正常癌旁組織。細胞轉染，嚴格按照脂質體說明書操作。轉染4 h后換培養液，在孵箱中繼續培養。

實施平板克隆形成實驗。轉染細胞接種到孔板中，每3 d換培養液，直至大部分腫瘤細胞克隆成功，PBS清洗并計數。

建立腫瘤模型。獲得動物管理委員會批準，選取健康裸鼠(SCXK2014-0002)，在無菌條件正常飲食下，將轉染的肝癌組織經皮下注射置入裸鼠，3 w后處死，取出腫瘤組織，測量體積。

Western印跡。將細胞轉染LATS2的MicroRNA表達作為對照，轉染48 h后，分析LATS2表達。采用PBS溶液清洗裂解細胞，蛋白濃度采用BCA法測定，同時采用SDS-PACE膠分析，分析條帶強度。

采用實時熒光RNA和免疫組織化學法測定觀察。嚴格按照RNA提取試劑盒操作，RNA濃度采用NanoDropND-1000分光光度計法測定，取500 ng RNA合成CDNA后進行PCR反應。將腫瘤組織切片脫水處理，加入3%醫用雙氧水，孵育5 min，清晰后采用PBS洗滌，山羊血封閉，滴加一抗孵育；然后采用生物素標記的二抗孵育，最后滴加辣根酶標記，顯微鏡下觀察。

將含有MicroRNA-31結合位點的LATS克隆到載體GFP下游，細胞轉后，轉染RFP作為內參，轉染48 h后，測定GFP熒光度。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 HBV感染不同時期MicroRNA-31表達比較 感染HBV后，細胞MicroRNA-31存在高表達情況。不同病情，MicroRNA-31表達存在一定差異。健康組MicroRNA-31表達水平(0.56±0.19)最低，肝癌組患者組織核細胞MicroRNA-31表達(0.83±0.31)顯著高于其他組(急性肝炎組、慢性肝炎組、肝硬化組分別為0.58±0.21、0.62±0.30、0.71±0.28)(P<0.05)。

2.2 平板克隆形成實驗 利用平板克隆實驗測定轉染細胞、SLC-1 細胞和MicroRNA-31ASO細胞生長情況。與對照組比較，轉染MicroRNA-31的腫瘤細胞克隆數增殖減少50%，差異顯著(P<0.05)。

2.3 體外成瘤實驗 將對照細胞以及轉染MicroRNA-31細胞注入到裸鼠體內，結果顯示，轉染MicroRNA-31后的肝癌細胞成瘤能力下降，而且腫瘤體積縮小。見圖1、圖2。

圖1 體外成瘤實驗腫瘤體積觀察

圖2 MicroRNA-31對肝癌細胞生長的影響

2.4 Western印跡檢測 細胞轉染后，LATS2表達水平提高1.5倍，PPP2R2A表達無明顯變化。

2.5 預測MicroRNA-31候選靶基因 生物學信息學法測定，MicroRNA-31與LATS2結合位點互補。

2.6 GFR報道載體實驗驗證MicroRNA-31靶基因 對照設為1，轉染MicroRNA-31細胞LATS2 3/UTR強度增強(1.5)，MicroRNA-31轉染對突變熒光強度(OP)無明顯影響。

2.7 MicroRNA-31對LATS2表達的影響 對照設為1，轉染LATS2 siRNA細胞中LATS2表達(0.2)顯著下降(P<0.05)。

3 討 論

MicroRNA是乙組內源性非編碼單鏈小RNA，能夠廣泛參與細胞增殖、分化以及炎癥等生理過程，能夠與目的基因3/端非編碼結合，通過降低信使RNA含量，組織DNA的翻譯。當前MicroRNA已經發現1 400多種，由于其廣泛具有生物學作用〔4〕，研究MicroRNA-31對肝癌細胞生物學作用對分子靶向治療有重要理論價值和現實意義。

有關MicroRNA-31的研究論文較多，多集中在皮膚癌、乳腺癌、食管癌等惡性腫瘤研究中，肝癌方面的研究不多〔5〕。研究證實MicroRNA在調節腫瘤生物學作用時，能夠發揮類似抑癌基因或者癌基因作用。關于不同MicroRNA的表達研究觀點也存在一定差異。多數學者認為在大多數的腫瘤細胞中，MicroRNA-31均呈現高表達，認為在惡性腫瘤發生發展中，MicroRNA-31能夠發揮癌基因的效果〔6〕。但是有關MicroRNA-31的研究觀點卻都存在較大的差異。乳腺癌研究中，發現MicroRNA-31能夠參與肺部轉移灶荷瘤減少，抑制乳腺癌的活動性、侵襲性，認為在乳腺癌中，MicroRNA-31屬于一種抑癌基因。在結腸癌相關研究中，發現MicroRNA-31高表達會提高腫瘤的侵襲性〔7〕，認為MicroRNA-31同樣具有癌基因的特點。MicroRNA-31在不同腫瘤中的研究觀點一直沒有統一，結腸癌、肺癌等高表達，卵巢癌、胃癌中則呈低表達。

有學者分析MicroRNA-31表達對肝纖維化的影響〔8〕，發現MicroRNA-31的表達受到TGF-β1的影響，認為MicroRNA-31表達與腫瘤血管生長有關〔9〕。本組臨床研究以HBV感染患者為研究對象，提示MicroRNA-31表達水平與HBV感染密切相關，可能參與病情進展，MicroRNA-31在肝癌中能夠發揮癌基因作用。MicroRNA-31在其他惡性腫瘤中發現存在高表達情況，如在皮膚癌患者中miR-31呈現高表達，并且與患者病情嚴重程度、預后相關〔10〕。為進一步分析MicroRNA-31對肝癌惡性腫瘤細胞生長的影響，在以往研究中發現MicroRNA-31能夠參與血管平滑肌的生長，認為MicroRNA-31表達與腫瘤進展有關〔11〕。本組研究結果，提示MicroRNA-31在惡性腫瘤發生發展中是癌基因的角色。

有學者發現MicroRNA與靶基因3/UTR并不是完全互補的，因此多認為MicroRNA-31能夠通過調節多個靶基因表達發揮癌基因作用〔12〕。有學者對肺癌患者進行研究，發現MicroRNA-31能夠通過影響LATS2以及PPP2R2A參與腫瘤細胞的生長。LATS2位于13號染色體上，能夠編碼蛋白激酶；很多學者在研究中發現，LATS2編碼的蛋白酶屬于腫瘤抑制信號途徑，能夠誘導癌基因失活，達到抑制腫瘤細胞生長作用。本組研究結果顯示MicroRNA-31能夠參與調節LAST2蛋白的表達，但是并沒有影響PPP2R2A表達，可能是因為不同腫瘤細胞中PPP2R2A的表達也存在變化，這點在皮膚癌研究中也觀察到。通過GFR實驗報告進一步證實MicroRNA-31能夠直接作用LATS1，MicroRNA-31抑制腫瘤細胞增殖可能是通過與3/URT結合抑制LATS2的表達，進而促進惡性腫瘤細胞增殖。采用實時定量PCR測定以及免疫組織化學法分析，肝癌匯總LATS1表達降低，敲除該基因后，細胞增殖能力增強，與轉染MicroRNA-31的相反，進一步說明LATS2是MicroRNA-31的靶基因，未來基因靶向治療中，可以考慮抑制MicroRNA-31表達，提高LATS2的水平。

1 王宏偉,段長虹,秦瑞英,等.小分子干擾RNA下調星形細胞上調基因1表達對肝癌細胞增殖和凋亡的影響〔J〕.中華實驗外科雜志,2014;31(5):982-4.

2 蔚丹丹,姚 敏,陳 潔,等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3轉錄干預對肝癌細胞侵襲和血管新生的抑制作用〔J〕.中華肝臟病雜志,2013;21(6):452-8.

3 胡 煊,熊兵紅,馬 利,等.結直腸癌患者血清 miR-31的表達變化及意義〔J〕.山東醫藥,2015;58(37):60-1.

4 羅湘玉,羅衛民,張 軍,等.miR-222基因轉染對人非小細胞肺癌細胞增殖與侵襲的影響〔J〕.山東醫藥,2015;58(31):14-6.

5 潘 杰,朱欣婷,劉 云,等.PEI-CS/siRNA復合顆粒對肝癌耐藥細胞BEL7402/5-FU中MRE11表達的影響〔J〕.現代生物醫學進展,2015;15(10):1844-7.

6 何吉文,李 華,向國安,等.腫瘤靶向性細胞穿膜肽介導小分子干擾RNA對肝癌細胞的抑制作用〔J〕.中華實驗外科雜志,2013;30(10):2040-3.

7 薛 飛,劉艷慧,張宏偉,等.B2型黑色素瘤抗原基因對肝細胞肝癌增殖的影響及其調控機制〔J〕.中華實驗外科雜志,2016;33(1):84-6.

8 汪 洋,褚忠華,劉建平,等.小干擾RNA調控多藥耐藥相關蛋白1基因對SMMC7721肝癌細胞株多藥耐藥性的影響〔J〕.中華實驗外科雜志,2013;30(9):1889-92.

9 謝斌輝,王小農,劉鳳恩,等.小干擾RNA靶向沉默CXCR2基因抑制肝癌細胞的增殖〔J〕.中華生物醫學工程雜志,2013;19(6):438-42.

10 馬 蕾,薛海波,管秀好,等.特應性皮炎患者外周血調節性T細胞及皮損中miR-31、Foxp3的表達〔J〕.中華皮膚科雜志,2013;46(7):462-5.

11 張麗靜,王園園,翟叢劼,等.結直腸癌中miR-31的表達及預測靶基因的生物信息學分析〔J〕.腫瘤防治研究,2015;42(10):1005-10.

12 雷尤春,高 建.乙型肝炎病毒表面抗原在HepG2細胞中調節微小RNA-31的表達〔J〕.中華肝臟病雜志,2014;22(3):219-22.

〔2016-08-29修回〕

(編輯 曲 莉)

內蒙古自治區自然科學基金項目(2014MS08116，2014MS0854)

1 內蒙古醫科大學附屬醫院

托 婭(1974-)，女，主任檢驗師，主要從事寄生蟲學、病院生物學研究。

木 蘭(1973-)，女，副教授，主要從事寄生蟲學、病院生物學研究。

R73

A

1005-9202(2016)23-5802-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.013