運用高通量RNA測序探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與免疫功能的關(guān)系

陶有娣 王 瀟 陳 健

(廈門大學醫(yī)學院，福建 廈門 361000)

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運用高通量RNA測序探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與免疫功能的關(guān)系

陶有娣 王 瀟 陳 健1

(廈門大學醫(yī)學院，福建 廈門 361000)

目的 探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與免疫功能的關(guān)系。方法 選取6例符合要求的絕經(jīng)后病人，3例骨質(zhì)疏松患者為實驗組，3例非骨質(zhì)疏松者為對照組。雙能X線吸收儀測定骨密度。空腹抽取肘靜脈血適量，提取外周血單個核細胞RNA。 Nanodrop分光光度計及瓊脂糖電泳對RNA進行質(zhì)檢，構(gòu)建RNA文庫。用 Illumina Hiseq2000平臺測序，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，尋找差異表達基因，并且對這些差異表達基因進行功能富集分析。結(jié)果 根據(jù)差異分析P<0.05閾值篩選兩組的差異基因，這些差異表達基因功能富集顯示，大多集中在與免疫相關(guān)的信號通路上，如防御反應(yīng)(IL-15,IL-1 RAP,TNFAIP6,TNFRSF4,IL-2RA,IL-8等)，免疫反應(yīng)(CD8A,CD8B,IL-15,TNFRSF13C CD79B,CD14等)，炎癥反應(yīng)(IL-15,CD24,TLR10,TNFAIP6等)，白細胞活化(IL-8,CD8A,CD8B等)和淋巴細胞活化(CD3G,CD8A,CD8B,THEMIS,KIR2DS4,KIR3DL1等)。結(jié)論 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生與患者的免疫功能改變有一定的關(guān)系。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松；高通量RNA測序；免疫功能

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松，源于絕經(jīng)期卵巢功能的退化，成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收失平衡，導致系統(tǒng)性骨骼紊亂，骨密度降低，骨組織微環(huán)境退化及骨折脆性與敏感性增加〔1〕。有研究表明，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中，雌激素缺乏導致T細胞活性增加，活化的T細胞分泌的一些炎性因子增加，如腫瘤壞死因子(TNF)-α、核因子(NF)κB受體活化因子受體的配體(RANKL),進一步提高了破骨細胞活性〔2〕。在雌激素缺乏的情況下，活化的T細胞與TNF的來源最密切。也有報道表明T細胞缺陷的裸鼠對卵巢切除后的骨量丟失具有保護作用〔3〕。說明T淋巴細胞在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中占重要的一部分。

在骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中，骨保護素(OPG)/RANKL/RANK 信號通路起重要作用〔4〕。與RANKL競爭結(jié)合RANK,調(diào)節(jié)破骨細胞的生成，而B淋巴細胞產(chǎn)生OPG占骨髓的64%，骨保護素負性調(diào)節(jié)破骨細胞的生成。研究表明，B淋巴細胞缺乏的小鼠表現(xiàn)出持續(xù)的骨質(zhì)疏松及骨髓中OPG水平下降，這種情況可以被B淋巴細胞重建所補救〔5〕。

高通量測序是近年來一個熱門的技術(shù)，主要特點是測序通量高，測序時間和成本顯著下降〔6〕。本研究運用高通量RNA測序技術(shù)，從基因水平進一步探討骨質(zhì)疏松與免疫功能間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗對象 選取6例絕經(jīng)后婦女，符合以下條件：(1)年齡50～60歲，絕經(jīng)2年以上、10年以下，自愿加入該實驗研究，所有受試者均來自廈門大學附屬中山醫(yī)院門診病人。(2)骨質(zhì)疏松組：符合1994年世界衛(wèi)生組織確立的骨質(zhì)疏松診斷標準，即雙能X線吸收儀測定股骨頸或腰椎骨密度T值<-2.5標準差。(3)健康對照組：雙能X線吸收儀測定股骨頸或腰椎骨密度T值>-1標準差。(4)以下情況兩組均予排除：近期或以前經(jīng)過抗骨質(zhì)疏松治療(雙磷酸鹽類，特立帕肽，雷尼酸鍶，雷洛昔芬)，近1個月使用過治療骨質(zhì)疏松中藥者，近3個月內(nèi)采用激素替代治療和使用降鈣素(密鈣息和益鈣寧等)，1年內(nèi)應(yīng)用唑來膦酸注射液者；以前或現(xiàn)在患影響骨或免疫系統(tǒng)疾病，包括早絕經(jīng)(絕經(jīng)年齡<40歲)、甲狀旁腺功能亢進、未經(jīng)治療的甲狀腺功能亢進、骨軟化癥、類風濕關(guān)節(jié)炎、痛風、多發(fā)性骨髓瘤、脊柱結(jié)核、腫瘤患者、人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、乙型或丙型慢性肝炎、慢性腎功能或肝衰竭，或嚴重畸形、殘廢、喪失勞動力；以前或現(xiàn)在采用影響骨與免疫系統(tǒng)的療法：長期類固醇治療，免疫抑制治療(化學療法，甲氨蝶呤，環(huán)孢素，TNF-α阻斷劑等)；合并新鮮骨折及嚴重多處骨折患者。

1.2 主要試劑、儀器 Trizol(美國Ambion 公司)；人淋巴細胞分離液CBD(中國斯坦姆生物公司)；RNA建庫TruSeq? RNA LT Sample Prep Kit v2(美國Illumina公司)，測序試劑 TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS，TruSeq SBS Kit v3-HS(200-cycles)(美國 illumina公司)；捕獲磁珠AmpureBeads(美國Beckman公司)；Qubit定量 Quant-iTTMPicoGreen? dsDNA Assay Kit (美國life公司)Hisq2000高通量測序儀；CBOT簇生成儀(美國Illumina公司)；Nanodrop(美國Thermo公司)；Qubit(美國Invitrogen公司)；普通PCR儀(美國Life公司)；電泳儀(中國天能公司)；凝膠成像系統(tǒng)(中國天能公司)

1.3 實驗步驟

1.3.1 提取RNA 空腹抽取6例研究對象肘靜脈血適量，加入等體積的人淋巴細胞分離液CBD，高速離心(2 000 r/min)分離出外周血單個核細胞，生理鹽水洗滌離心1次，棄上清，加1 ml TRIzol試劑混勻，再經(jīng)純化提取外周血單個核細胞RNA，測定濃度。

1.3.2 RNA質(zhì)檢 用1 μl Nanodrop儀器(美國Thermo公司)對提取的RNA進行質(zhì)檢。

1.3.3 構(gòu)建測序文庫 將RNA分子隨機打斷并使用隨機引物將RNA片段反轉(zhuǎn)錄成cDNA分子，然后兩端加上特定的接頭。

1.3.4 錨定橋接 測序過程都在Illumina公司提供的流動槽中進行。一個標準的流動槽含有8個通道,每個通道的內(nèi)表面有無數(shù)被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，用于接下來的橋式PCR擴增。加入每個通道的是之前構(gòu)建好的DNA片段文庫。

1.3.5 預擴增 添加未標記的dNTP和普通Taq酶進行固相橋式PCR擴增，單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性釋放出互補的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環(huán)，將會在流動槽的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。

1.3.6 單堿基延伸測序 在測序的流動槽中加入四種熒光標記的dNTP、DNA聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每加入一個被熒光標記的dNTP就能釋放出相對應(yīng)的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，并通過計算機軟件將光信號轉(zhuǎn)化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。計算機軟件將同一位置坐標上檢測到的堿基依次連接，形成讀段。

1.4 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用 SPSS13.0 軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 采用Tophat軟件對預處理后樣本序列與參考基因組序列進行全基因組序列比對，計算序列的全基因 組覆蓋情況和計算RNA 的表達量，使用基因組為hg19，比對參數(shù)使用默認。結(jié)果顯示各個樣本的定位百分比均在90%以上，即樣本RNA合格，可以用于下一步的測序步驟。見表1。

表1 六個樣本的質(zhì)檢比對概述

項目骨質(zhì)疏松組185R186R188R非骨質(zhì)疏松組190R192R334D原始讀段數(shù)目20,541,05419,148,91119,861,15519,060,99718,987,93316,223,061定位百分比94.61%94.16%94.27%94.14%93.82%92.59%豐度5.42%4.25%5.06%6.81%4.57%2.92%未定位百分比5.39%5.84%5.73%5.86%6.18%7.41%

原始讀段數(shù)目：各個樣本原始讀段數(shù)目；定位百分比：定位上的讀段數(shù)占原始讀段總數(shù)的百分比；豐度：定位在高豐度基因(例如核糖體rRNA)上的讀段數(shù)占原始讀段總數(shù)的百分比；未定位百分比：未定位上的讀段數(shù)占原始讀段的總數(shù)百分比

2.2 基因體富集分析(GO) 根據(jù)P<0.05篩選出兩組的差異表達基因，將獲得的差異基因列表或者轉(zhuǎn)錄本列表通過DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)進行GO(Gene Ontology)富集分析，研究差異基因在GO中的分布狀況將闡明實驗中樣本差異在基因功能上的體現(xiàn)。GO分為三類：生物學過程(biological process)，分子功能(molecular function)和細胞組成(cellular componen)。結(jié)果顯示這些差異表達基因在生物功能方面，大多與免疫功能相關(guān)，如防御反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、白細胞活化等。見表2。

2.3 全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(KEGG)通路(Pathnay)富集分析 在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學功能，通過Pathway 顯著性富集分析能夠確定差異基因參與的最主要的生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。KEGG (Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes，www.genome.jp/kegg/)是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫。將獲得的差異基因列表或者轉(zhuǎn)錄本列表通過DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)進行KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示差異基因富集在與免疫相關(guān)的信號通路上。 見表3。

表2 通過P<0.05篩選得到絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組差異表達基因，對差異表達基因進行GO功能富集

目錄名稱P值基因生物功能防御反應(yīng)1.60E-07S100A8,IL-15,IL1RAP,LTF,TNFAIP6,CD40LG,TNFRSF4,CD24,IL2RA,IL-8,RNASE3,S100A12,CD19,P2RX1,CD14…免疫反應(yīng)4.46E-07CD8A,CD8B,IL-15,LTF,DPP8,PRG2,CD40LG,TNFRSF4,CD24,TLR10,IL-2RA,IL-8,TNFRSF13C,CD79B,CD14…炎癥反應(yīng)2.16E-05CCL3,S100A8,IL-15,TNFRSF4,FOS,MEFV,CD24,TLR10,IL-2RA,IL-8,S100A12,TNFAIP6,CD14…白細胞活化5.83E-05IL-8,CD8A,CD8B,IL-15,TNFRSF4,IFNAR1,AZU1,CD40LG,LAX1,CD2,CD24,KIR3DL1,DPP4…淋巴細胞活化2.38E-04CD3G,CD8A,CD8B,THEMIS,KIR2DS4,IL-15,TNFRSF4,IFNAR1,CD40LG,LAX1,MS4A1,CD2,CD24,KIR3DL1,DPP4…分子功能氧氣運輸活性4.21E-06HBM,HBQ1,HBG1,HBA2,HBG2,HBA1,HBB,HBD細胞因子結(jié)合1.70E-05IL-2RA,CMKLR1,TNFRSF25,TGFBR1,ELANE,CXCR1,CXCR2,TNFRSF4,IL-11RA,IFNAR1,CCR6,CCR5,IL1RAP,TGFBR3,IL5RA,THBS1…氧氣結(jié)合2.94E-05HBM,HBQ1,HBG1,HBA2,CYP4F3,CYP2E1,HBG2,HBA1,HBB,SOD2HBD…碳水化合物結(jié)合0.0011838ENPP3,FCER2,CLEC17A,CD69,CD22,CLEC4C,CD24,PRG2,CLC,TNFAIP6,SI-GLEC1,KLRG1,CLEC12A,IGF2R,CLEC12B,TGFBR3,CD14…血紅素結(jié)合0.002341HBM,CYP2D6,FADS3,HBA2,HBA1,CYP2E1,CYP27A1,HBQ1,MPO,CYP4F3,HBG1,HBG2,HBB,HBD…細胞組成質(zhì)膜部分1.42E-10SEC31B,SLC22A18,RALB,SLC4A1,KLRD1,KIR2DL1,SYT11,NOTCH2,SLC4A10,SYTL2,TP53I13,SORL1,SYNGR1,KCNIP2,PILRB,RAP2A…細胞表面3.48E-04CD69,CD2,RC3H2,CD22,MS4A2,FCER1A,IL-2RA,ELANE,TNFRSF13C,NOTCH2,CD19,CCR5,TGFBR3,AMOT,CD226,TP53I13,CTSG…胞外區(qū)域0.004373UTS2,MMP8,PGLYRP1,CBLN3,RETN,LYNX1,COLQ,CD40LG,CCL3FCER2,PI3,TGFBR3,CD8A,CD8B,MMP28,MMP25,LNPEP,CAMP,CA2…

表3 根據(jù)P<0.05,篩選得到絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松組與非骨質(zhì)疏松組差異表達基因，對其進行Pathway顯著性分析

KEGG通路基因數(shù)P值基因抗原呈遞通路124.58E-04HLA-DQB1,CD8A,CD8B,HLA-DRB5,KIR2DS4,KIR2DL1,HS-PA1A,KIR2DL3,KLRD1,HLA-DOB,KIR3DL1,KIR2DL4自然殺傷細胞介導的細胞毒性通路158.83E-04PIK3CG,KIR2DS4,IFNAR1,TNFRSF10C,PIK3CA,KIR2DL1,PPP3CA,KIR2DL3,NFATC2,PIK3R3,SH2D1B,FCGR3B,KLRD1,KIR3DL1,KIR2DL4趨化因子信號通路160.008356457PIK3CG,CCL3,GNAI3,ROCK1,IL-8,ROCK2,CXCR1,CXCR2,FOXO3,CCR6,CCR5,ADCY9,PIK3CA,PIK3R3,PLCB1,GNG7B細胞受體信號通路90.010366428PIK3CG,FOS,CD19,CD22,PIK3CA,CD79B,PPP3CA,PIK3R3,NFATC2T細胞受體信號通路100.030121964PIK3CG,FOS,CD3G,CD8A,CD8B,CD40LG,PIK3CA,PPP3CA,PIK3R3,NFATC2

基因數(shù)：富集到該KEGG通路的基因數(shù)

3 討 論

骨骼與免疫系統(tǒng)在細胞起源、空間分布、功能及調(diào)控等方面存在許多相似性，免疫與骨骼系統(tǒng)有一些共同的調(diào)節(jié)因子，如細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及受體〔7〕。Arron等〔8〕于2000年第一次使用骨免疫學描述免疫細胞與骨骼系統(tǒng)之間的相互作用。這兩者間的密切聯(lián)系使得在生理及病理條件下均相互作用，尤其是一個系統(tǒng)的病態(tài)激活影響另一個系統(tǒng)，如類風濕關(guān)節(jié)炎中，免疫系統(tǒng)的異常活化影響骨重建導致病理性骨吸收〔9〕。而且，在慢性炎癥狀態(tài)，骨形成與骨吸收之間的平衡偏向于破骨介導的骨吸收，尤其是近年來對OPG/RANKL/RANK〔10〕系統(tǒng)的深入研究，使人們對骨與免疫系統(tǒng)之間的相互作用機制有更深的認識。RANK屬于TNF超家族，很多的組織及細胞均表達RANK，如骨骼肌、肝臟、乳腺，單核巨噬細胞系、B、T淋巴細胞、樹突細胞等。RANK的活化可刺激破骨前體細胞向成熟的破骨細胞分化及成熟的破骨細胞活化。RANKL 同樣屬于TNF超家族。骨組織及骨外組織細胞均可表達RANKL，如成骨細胞、骨髓基質(zhì)細、骨細胞、乳腺等〔11〕。而且，免疫系統(tǒng)的很多細胞也可表達RANKL，如單核細胞、中性粒細胞、樹突細胞、B、T淋巴細胞。已知這些免疫細胞可以產(chǎn)生促炎性細胞因子，通過加強RANK/RANKL信號通路導致骨破壞〔10〕。

高通量RNA測序，在測序過程中，由于RNA隨機片段化和采用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄等，所得cDNA片段較均勻地取自各轉(zhuǎn)錄本。因此，RNA測序得到的讀段可以視為對轉(zhuǎn)錄組隨機打斷后的隨機采樣，這是人們使用統(tǒng)計模型來對轉(zhuǎn)錄組和基因表達作參數(shù)估計分析的理論基礎(chǔ)〔12〕。

有研究表明，骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生與很多慢性炎癥性疾病相關(guān)，如類風濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性阻塞性肺疾病及一些病毒感染〔13〕。Breuil等〔14〕觀察26例伴有骨質(zhì)疏松性骨折的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性及24例年齡和雌激素水平匹配的健康對照組的免疫細胞的表型和功能特性。他們首次觀察到B淋巴細胞數(shù)目減少，由此推測B細胞的這種改變可能與體內(nèi)骨髓微環(huán)境改變有關(guān)，并且獨立于年齡和雌激素狀態(tài)。本實驗GO富集分析顯示兩組差異表達基因在生物功能方面大多與免疫功能相關(guān)，如防御反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、白細胞活化等。KEGG通路分析結(jié)果表明，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生與免疫功能改變有一定的關(guān)系。由此推測絕經(jīng)后，患者自身免疫功能與骨微環(huán)境相互作用，引起骨形成與骨吸收之間的平衡偏向于破骨介導的骨吸收。

目前兩種主要治療骨質(zhì)疏松的藥物是抑制骨吸收和刺激新骨形成。抑制骨吸收藥物包括雙膦酸鹽類，如依替膦酸鈉、阿侖膦酸鈉、利塞膦酸鈉和唑來膦酸;雌激素與選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑——雷洛昔芬;鮭魚降鈣素和狄諾塞麥。目前唯一的刺激新骨形成藥物是特立帕肽〔15〕。本實驗從基因表達水平研究骨質(zhì)疏松與免疫功能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩組絕經(jīng)后病人的差異表達基因大部分集中在與免疫功能相關(guān)的信號通路上。

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〔2016-01-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

Relationship between postmenopausal osteoporosis and immune function

TAO You-Di, WANG Xiao, CHEN Jian.

College of Medicine，Xiamen University，Xiamen 361000，F(xiàn)ujian，China

Objective To detect the relationship between postmenopausal osteoporosis and immune function.Methods The study involved 6 women, including 3 postmenopausal osteoporosis and 3 postmenopausal non-osteoporotic women. BMD measurement was performed by dual-energy X-ray absorptiometry. After an overnight fast, morning blood was drawn from the candidates. Total RNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells. RNA quality and purity were confirmed with a Nanodrop spectrophotometer and electrophoresis. RNA library was constructed. With Illumina Hiseq 2000 sequencing platform, dates and searched for differentially expressed genes(DEGs)were collected. Afterwards, functional and pathway analyses were conducted.Results The DEGs were mainly enriched in GO term of defense response (e.g.,IL-15,IL-1 RAP,TNFAIP6,TNFRSF4,IL-2 RA,IL-8),immune response(e.g., CD8A,CD8B,IL-15,TNFRSF13C,CD79B,CD14),inflammatory response(e.g., IL-15,CD24,TLR10,TNFAIP6),leukocyte activation(e.g., IL-8,CD8A,CD8B),lymphocyte activation(e.g., CD3G,CD8A,CD8B,THEMIS,KIR2DS4,KIR3DL1).Conclusions The postmenopausal osteoporosis is associated with changes of immune function.

Postmenopausal osteoporosis; High-throughput RNA sequencing; Immune function

國家自然科學基金資助項目(No.81272168);福建省醫(yī)學創(chuàng)新課題資助項目(No.2012-CXB-32)

1 廈門大學附屬中山醫(yī)院康復醫(yī)學科

陳 健(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

陶有娣(1989-)，女，在讀碩士，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

R3

A

1005-9202(2016)23-5812-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.017