苗藥對三叉神經痛大鼠三叉神經節p-ERK1/2表達的影響

吳遠華 司凱隆

(貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002)

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苗藥對三叉神經痛大鼠三叉神經節p-ERK1/2表達的影響

吳遠華 司凱隆1

(貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002)

目的 探討三叉神經痛的發病機制及苗藥血飛蓽茇定痛湯治療該癥的應用價值。方法 采用祛風清熱通絡法，運用慢性縮窄環法制作三叉神經痛模型大鼠，造模成功后進行模型動物三叉神經節離體培養，對培養后的神經節進行WEIL髓鞘染色、HE染色與甲苯胺藍染液染色和常規電鏡制片。采用免疫組化檢測p-ERK1/2的表達。結果 光電鏡結果顯示：陰性和低劑量組神經纖維變性，軸突不規則或消失；中、高劑量組及空白組神經纖維未見明顯變化。卡馬西平組三叉神經節p-ERK1/2表達量最低，其余造模組均高于卡馬西平組，依次為：中劑量組<高劑量組<陰性對照組<低劑量組<空白組；苗藥對卡馬西平組三叉神經節p-ERK1/2表達的抑制作用最強，高、中劑量組明顯低于空白組，高、中劑量組p-ERK1/2表達量下調(P<0.05)。結論 一定劑量的苗藥可能緩解三叉神經痛，可能是通過抑制ERK的激活而實現的。

三叉神經痛；三叉神經節；祛風清熱通絡法

原發性三叉神經痛是一種臨床上常見的疾病，其特點是面部發作性的劇烈疼痛，發病率達0.4%～0.5%〔1〕，但其發病機制尚不完全明確。中醫認為：肝風內動，肝胃火盛，風火相燔，竄逆于面，瘀阻脈絡，不通則痛，腎功能失常亦通過影響肝胃而致病，故在病機分析中肝胃為主病臟腑。苗藥有祛風清熱通絡之功效，常用來祛瘀止痛等。根據中醫肝胃藏象及經絡理論，在苗藥血飛蓽茇定痛湯穴臨床運用療效滿意的基礎上，擬以祛風清熱通絡法為核心治法對三叉神經痛模型大鼠展開實驗研究，探討苗藥血飛蓽茇定痛湯治療的作用機制和靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 苗藥血飛蓽茇定痛湯方藥制劑由貴陽中醫學院第一附屬醫院中藥制劑室提供，配方組成：見血飛(飛龍掌血)、苕葉細辛、白芷、全蝎，蜈蚣、大血藤、川芎、赤芍、白芍、炙甘草。

1.2 實驗動物的選擇、分組及給藥方法 成年雄性健康SD大鼠，體質量(250±20)g。在術前對疼痛閾值(作為基礎痛閾)進行測定，并實施左側眶下神經-慢性縮窄損傷(ION-CCI)環扎術。術后14 d，觀察大鼠是否出現痛覺超敏現象，并納入出現該現象的大鼠。納入大鼠通過隨機數字表法分組：空白組：自然環境、普通飼料飼養，以生理鹽水灌胃，1次/d，共14 d；陰性組：測定術前疼痛閾值(作為基礎痛閾)后，進行左側眶下神經(ION-CC)環扎術制作三叉神經痛大鼠模型，通過對環扎線標記比較其松緊度及手術線的選擇等優化選擇造模方法的指標，選出最優造模方案。造模成功后以生理鹽水灌胃，1次/d，共14 d；治療組：造模成功后給予苗藥血飛蓽茇定痛湯灌胃，高、中、低劑量分別按成人臨床用藥劑量的20倍、10倍、5倍計算，灌胃1次/d，共14 d；陽性對照藥卡馬西平組：造模成功后給予卡馬西平治療，相當于成人劑量的10倍，灌胃1次/d，共14 d。

1.3 超微結構與病理形態學觀察 術后14 d，處死各組大鼠，將大鼠三叉神經節、眶下神經組織取出后，選擇10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，分別進行WEIL髓鞘染色、蘇木素-伊紅(HE)染色與甲苯胺藍染液染色(著色后的節細胞藍染)。之后常規電鏡制片，進行觀察。

1.4 p-ERK1/2表達的檢測 各組大鼠完成實驗后，在規定時間內通過1%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉(40 mg/kg體重)。麻醉后予以開胸，將右心耳剪開，并從左心室插管至主動脈，選擇150 ml 0.9%氯化鈉注射液(室溫)快速灌注后，再以含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸鈉鹽緩沖液(PBS)500 ml(4℃)灌注固定2 h。將大鼠腦組織取出，置入含300 g/L蔗糖的0.1 mol/L PBS內，在4℃冰箱中放置，直到沉底。冠狀冰凍切片，切片厚度為20 μm。嚴格按照說明書要求進行p-ERK免疫組織化學染色。通過IPP 6.0圖像分析系統對表達進行檢測，并對三叉神經節(10×20倍)視野中p-ERK陽性細胞區域的積分光密度值總和(Dsum)予以測定，計算平均光密度值。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 光鏡觀察 低劑量組與陰性組大鼠神經纖維變性增粗、腫脹，軸突不規則或消失，未見神經節細胞，半髓鞘增厚，疏松、瓦解或呈節段性脫髓鞘，纖維松解斷，神經周圍小動脈管壁增厚，管腔狹窄，大部分病例神經周圍纖維組織增生。中、高劑量組及空白組神經纖維未見明顯變化。見圖1。

2.2 電鏡觀察 陰性和低劑量組神經纖維髓鞘增生、結構紊亂，軸突變細或消失；線粒體腫脹，數量增多，位于軸突的邊緣。中、高劑量組及空白組神經纖維髓鞘及線粒體未見明顯變化。見圖2。

圖1 各組光鏡檢查結果(HE染色)

圖2 各組電鏡檢查結果

2.3 三叉神經節中p-ERK1/2表達 卡馬西平組三叉神經節p-ERK1/2表達量最低(0.271 2±0.036 3)，其余造模組均高于卡馬西平組，依次為：中劑量組(0.284 8±0.019 3)<高劑量組(0.289 7±0.032 9)<陰性對照組(0.317 2±0.031 3)<低劑量組(0.337 7±0.032 5)<空白組(0.344 8±0.047 5)；苗藥對卡馬西平組三叉神經節p-ERK1/2表達的抑制作用最強，高、中劑量組明顯低于空白組(P<0.05)。

3 討 論

祖國醫學認為，面痛為肝膽風火或陽明燥熱，久病入絡，瘀血阻滯經脈所致。面部為陽明經(胃經)及少陽經(膽經)所過之處。根據經絡理論，胃與大腸均屬陽明、膽為少陽，足厥陰肝經與膽、胃二經經氣相通。《靈樞·經脈》曰：“肝足厥陰之脈…，挾胃，屬肝、絡膽。本病呈發作性，突發突止，符合肝風的特性，肝膽火盛，肝胃郁熱或肝腎陰虛，虛風內動，挾胃膽二經之氣血隨之升騰上逆，上擾面之清竅，流竄面之經絡，引動絡之伏邪而發為面痛。故該病與肝胃關系密切，治療以祛風清熱通絡法為核心，以血飛蓽茇定痛湯平肝熄風，清胃瀉熱，祛瘀止痛。

原發性三叉神經痛屬神經系統常見病，主要表現為三叉神經分布區不同程度的針刺樣、撕裂樣及電擊樣疼痛，持續時間十幾秒到數分鐘不等，呈陣發性，疼痛劇烈且急驟，嚴重者甚至會對咀嚼及語言功能造成影響，復發率高，病程遷延難愈。卡馬西平是目前治療該癥的首選藥物，但此藥物可引起多種中樞神經系統相關的副作用，患者難以耐受，治療依從性較差。

對于原發性三叉神經痛的病因一直存在爭議，有研究發現三叉神經痛的半月神經節和周圍支有明顯的髓鞘增生與退行性變〔2〕。與本研究的觀察結果一致，提示三叉神經的脫髓鞘改變是三叉神經痛的主要病理改變和主要病因，髓鞘變性，可使神經節部分或全部脫髓鞘，使神經軸突暴露，當這些暴露的神經軸突相互接觸時，可產生觸電樣的陣發性疼痛。當脫髓鞘的軸突與一個失去了雪旺細胞并且變性的無髓鞘軸突相接觸時，同樣可發生這樣的情況。這種短路一直要持續到變性的神經軸突消失為止，疼痛才能緩解。當產生其他脫髓鞘神經軸突變性時，疼痛又可再度發生而使病情加劇。

有研究指出：白芷中的總香豆素類成分具有明顯的鎮痛作用〔3〕；血藤中的地血香成分具有祛風除濕，散瘀活絡等作用〔4〕；赤芍與其他中藥聯合使用，具有行氣止痛、活血定痛等功效，起到保護神經細胞的作用〔5〕；而見血飛具有明顯的鎮痛效果在文獻中也有提到〔6〕；在現代藥理研究中提到川芎具有擴張血管，加速血流，開放毛細血管網，改善微循環的作用〔7〕。用祛風清熱通絡法治療三叉神經痛，其療效好，可以緩解三叉神經痛患者的疼痛癥狀。

真核細胞內存在廣泛的絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路，對細胞的分化、增殖以及細胞凋亡抑制等功能具有促進作用，其主要由3條通路組成，分別為P38信號通路、ERK1/2信號通路、JNK信號通路〔8〕。而在細胞信號轉導網絡中處于樞紐地位的ERK1/2通路會受到神經遞質、激素、血管肽類及炎性因子等細胞外信號分子刺激，并通過G-蛋白和細胞內一系列蛋白激酶級聯活化反應及跨膜信號轉導，使膜受體出現一系列生物學效應，如表達調變、細胞生長、分化、增殖和移動等〔9，10〕；細胞外信號相關蛋白激酶(ERK)是信號通路多個上游區調節器的最后共同效應器，是將信號從膜表面受體轉導到細胞核的關鍵。因此只要阻滯了ERK的激活，就有可能阻止胞外信號向胞內的轉導，從而影響中樞致敏和突觸的可塑性〔11〕。有研究指出，ERK1/2在三叉神經脊束核痛覺信號的傳導和調節中起重要作用〔12〕。p-ERK是初級傳入感受傷害神經元興奮的重要解剖學標志〔13〕。因此，監測p-ERK1/2的表達量可衡量痛覺信號傳導。

本研究結果推測，苗藥中某些成分使p-ERK1/2表達下調，影響細胞信號的傳導，負責疼痛信號傳導的蛋白或酶不能接受信號而不能發生后續的酶聯反應，從而減少了疼痛的表現。相類似的研究如Chen等〔14〕發現，在周圍神經CCI術后引起的神經病理性痛的動物模型中，鞘內給予ERK抑制劑PD98059后可以減輕大鼠神經病理性痛的表現，說明在產生痛覺敏化的過程中脊髓背角ERK的激活起了關鍵作用。

另外，苗藥中含有多種止痛鎮痛的成分。在多種成分的共同鎮痛作用下，使起作用的有效分子的含量增高，而細胞外信號分子含量相對減少，信號不能從胞內傳到胞外，跨膜分子的級聯反應受到影響，ERK激活受阻，進而影響其合成，疼痛信號傳導不能正常進行。

1 秦泗佳，王 福.原發性三叉神經痛發病機制的研究進展〔J〕.中華神經外科雜志，2012；28(12)：1293-5.

2 Liu Y，Li J，Butzkueven H，etal.Microstructural abnormalities in the trigeminal nerves of patients with trigeminal neuralgia revealed by multiplediffusion metrics〔J〕.Eur J Radiol，2013；82(5)：783-6.

3 高小坤.白芷揮發油鎮痛、鎮靜作用實驗研究〔J〕.現代中西醫結合雜志，2013；22(35)：3880-2，3888.

4 陳茹茹，劉正君，唐俊峰，等.大血藤化學成分提取方法和藥理作用的研究進展〔J〕.海峽藥學，2014；26(5)：3-5.

5 陸小華，馬 驍，王 建，等.赤芍的化學成分和藥理作用研究進展〔J〕.中草藥，2015，46(4)：595-602.

6 云雪林.苗藥飛龍掌血的藥理作用和臨床應用研究進展〔J〕.中國民族醫藥雜志，2012，18(7)：58-60.

7 王永忠，童樹洪.川芎的傳統用法與現代藥理研究〔J〕.中國藥業，2012；21(7)：95-6.

8 Chueh FS，Chen YY，Huang AC，etal.Bufalin-inhibited migration and invasion in human osteosarcoma U-2 OS cells is carried out by suppression of the matrix metalloproteinase-2，ERK，and JNK Signaling Pathways〔J〕.Environ Toxicol，2014；29(1/2)：21-9.

9 Woolley MJ，Watkins HA，Taddese B,etal.The role of ECL2 in CGRP receptor activation：a combined modelling and experimental approach〔J〕.J R Soc Interface，2013；10(88)：20130589.

10 Hamel LP，Nicole MC，Duplessis S，etal.Mitogen-activated protein kinase signaling in plant-interacting fungi：distinct messages from conserved messengers.〔J〕.Plant Cell，2012；24(4)：1327-51.

11 汪挺艦，楊治權.三叉神經痛的動物模型研究進展〔J〕.中華實驗外科雜志，2014；31(4)：925-6.

12 江新泉，孫利利，馬 娜，等.偏頭痛模型大鼠三叉神經脊束核磷酸化ERK1/2水平變化〔J〕.中華行為醫學與腦科學雜志，2014；23(9)：781-3.

13 Park MH，Galan HL，Arroyo JA,etal.Effect of hypoxia on endothelial nitric oxide synthase，NO production，intracellular survival signaling (p-ERK1/2 and p-AKT)and apoptosis in human term trophoblast〔J〕.Am J Reprod Immunol，2011；65(4)：407-14.

14 Chen XY，Cai HZ，Wang XY，etal.Application of the ERK signaling pathway inhibitor PD98059 in long-term in vivo experiments〔J〕.Genet Mol Res，2015；14(4)：18325-33.

〔2016-02-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

貴州省科學技術基金項目：黔科合J字〔2011〕2303號

1 貴陽中醫學院

司凱隆(1989-)，男，住院醫師，主要從事中西醫結合神經性疼痛的研究。

吳遠華(1976-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事中西醫結合治療腦血管病研究。

R745.1+1

A

1005-9202(2016)23-5824-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.022