珍龍醒腦膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷細胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

項穎卿 涂長春 章國良

(江西科技學院護理學院，江西 南昌 330098)

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珍龍醒腦膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷細胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響

項穎卿 涂長春1章國良2

(江西科技學院護理學院，江西 南昌 330098)

目的 探討珍龍醒腦膠囊對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷細胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3表達的影響。方法 健康SD大鼠隨機分為假手術組、腦缺血再灌注損傷模型組、珍龍醒腦低(50 mg·kg-1·d-1)、中(100 mg·kg-1·d-1)和高劑量組(200 mg·kg-1·d-1)。每組6只。術前實驗性灌胃給藥，珍龍醒腦組分別灌注不同劑量藥液，假手術組和模型組灌注等量生理鹽水。連續給藥7 d后采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注損傷模型。假手術組和模型組給予生理鹽水。術后6、12、24、48、72 h斷頭取腦。用TUNEL法檢測大鼠皮質和海馬神經細胞凋亡率，免疫組化法觀察Bcl-2、Caspase-3蛋白表達。結果 與模型組比較，珍龍醒腦組神經細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達上調、Caspase-3 蛋白表達下調(P均<0.01)，珍龍醒腦中、高劑量組與低劑量組比較，神經細胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表達上調、Caspase-3 蛋白表達下調(P均<0.01)。結論 珍龍醒腦可抑制大鼠神經細胞凋亡，促進缺血腦組織Bcl-2表達、抑制Caspase-3表達，以珍龍醒腦中、高劑量效果明顯。

珍龍醒腦；腦缺血再灌注損傷；細胞凋亡

研究發現〔1〕，珍龍醒腦膠囊可以溶解血栓、消除動脈粥樣硬化斑塊、解除血管平滑肌痙攣、擴張血管、改善微循環、增加血流速度、降低血液黏度、擴張微小動靜脈、降低腦血管通透性，減少自由基損傷、改善腦梗死的預后，尤其在減少腦梗死后遺癥、促進語言肢體機能恢復等方面療效顯著。動物實驗證明珍龍醒腦膠囊通過降低丙二醛(MDA)含量，升高超氧化物歧化酶(SOD)、Na+-K+-ATP酶活力，有效降低腦含水量，對小鼠腦缺氧及缺血再灌注損傷具有保護作用，其抗腦缺血再灌注損傷作用與保護腦組織ATP酶活性、抑制脂質過氧化反應和減輕自由基損傷有關〔2〕。有關珍龍醒腦膠囊對神經細胞凋亡影響的報道很少。本實驗觀察珍龍醒腦膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠神經細胞凋亡及凋亡相關蛋白Bcl-2、Caspase-3蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠，雌雄各半，體重220～300 g,由江西中醫藥大學動物科學部提供。合格證號：JZDW No2013-0024。

1.2 藥物與試劑 珍龍醒腦膠囊，青海金訶藏藥藥業股份有限公司生產，批號：國藥準字Z20026000；TUNEL試劑盒由南京凱基生物科技發展有限公司提供，Bcl-2、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體，SP 法免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒，均由北京博奧森生物技術有限公司生產。

1.3 分組與給藥 健康SD大鼠隨機分為假手術組、腦缺血再灌注模型組、珍龍醒腦低(50 mg·kg-1·d-1)、中(100 mg·kg-1·d-1)和高劑量組(200 mg·kg-1·d-1)。每組6只。術前實驗性灌胃給藥，珍龍醒腦組組分別灌注不同劑量藥液，假手術組和模型組灌注等量生理鹽水。連續給藥7 d。采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注損傷模型。假手術組和模型組給予生理鹽水。

1.4 造模及取材 采用改良Longa等〔3〕線栓法建立局灶性腦缺血再灌注模型。假手術組除不插線外，其余步驟相同。 模型制作成功后，在各時間點取材，水合氯醛過量麻醉，迅速開胸暴露心臟，經升主動脈插管后灌注生理鹽水250 ml剪開右耳，快速沖洗，再用4%多聚甲醛250 ml灌注，直到頭部變硬，斷頭取腦，去除嗅球、小腦和腦干。冰盤上迅速分離大腦半球，棄去健側，取視交叉前后約20～30 mm范圍的冠狀切片，放入10%福爾馬林中固定，24 h之內石蠟包埋。

1.5 TUNEL神經細胞凋亡檢測 腦組織按常規石蠟包埋，TUNEL法標記凋亡細胞，蘇木素復染。在光鏡下，正常細胞的細胞核呈藍色，而凋亡細胞核則呈深淺不一的棕褐色。每張切片隨機選取5個不重疊的視野，輸入計算機進行圖像分析，計算每個視野的凋亡細胞個數和正常細胞數，計算細胞凋亡指數，取平均值。

1.6 Bcl-2、Caspase-3免疫組化檢測 取石蠟切片，脫蠟至水。采用SP免疫組化法觀察Bcl-2、Caspase-3蛋白表達。陰性對照組以0.01 mol/L PBS代替一抗，其余步驟不變。鏡下觀察胞質呈棕褐色的細胞為陽性細胞。數碼相機進行顯微攝影。每張切片隨機選取5個不重疊的視野，采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件系統進行圖像采集(顯微鏡20×10倍)，測定陽性表達的面積密度和平均光密度，計算整合光密度(IOD)。IOD=面積密度×平均光密度。

1.7 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件進行單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 神經細胞凋亡情況 假手術組未見或僅見少量凋亡細胞。模型組可見缺血半暗帶區內有大量凋亡細胞存在。光鏡下凋亡細胞表現為胞核被染成淡棕色。腦缺血再灌注6 h后，神經細胞已經出現凋亡，此后神經細胞凋亡率逐漸升高，腦缺血后24～48 h達到高峰，72 h后呈現下降趨勢。模型組各時間段神經細胞凋亡率明顯高于假手術組(P<0.01)。珍龍醒腦組各時間段神經細胞凋亡率與模型組比較明顯減少(P均<0.01)；珍龍醒腦中、高劑量組與低劑量組比較，神經細胞凋亡率明顯減少(P均<0.01)。見表1。

2.2 大腦皮層及海馬區Bcl-2蛋白表達情況 Bcl-2陽性細胞主要位于海馬及皮層缺血梗死灶邊緣缺血半暗帶區，梗死灶中心區少見陽性細胞，陽性細胞主要是神經元細胞和小膠質細胞，胞質呈棕黃色，染色均勻。結果顯示，模型組和珍龍醒腦組腦缺血再灌注6 h后Bcl-2表達增加，12～24 h達高峰，48 h后呈現下降趨勢，與假手術組比較差異顯著(P均<0.01)。珍龍醒腦組與模型組比較，大鼠缺血區皮質和海馬Bcl-2陽性表達均明顯增加(P均<0.01)，珍龍醒腦中、高劑量組與低劑量組比較，Bcl-2表達明顯增加(P均<0.01)。見表2。

2.3 大腦皮層及海馬區Caspase-3蛋白表達情況 假手術組Caspase-3表達極少，模型組缺血6 h后Caspase-3表達增加，12～24 h達高峰，48 h后呈現下降趨勢。珍龍醒腦組與模型組比較，大鼠缺血區皮質和海馬Caspase-3陽性表達均明顯減少(P均<0.01)，珍龍醒腦中、高劑量組與低劑量組比較，Caspase-3表達明顯減少(P均<0.01)。見表3。

表1 珍龍醒腦對大鼠不同時間段腦缺血再灌注損傷神經細胞凋亡率的影響(n=6,)

組別6h12h24h48h72h假手術組模型組珍龍醒腦低劑量組珍龍醒腦中劑量組珍龍醒腦高劑量組0.96±0.2838.03±3.121)26.45±1.232)14.25±1.042)3)13.24±1.722)3)1.04±0.1355.67±2.741)26.34±3.192)17.15±2.732)3)16.53±1.652)3)0.90±0.0868.72±2.951)45.37±3.082)22.18±2.772)3)20.72±3.132)3)1.03±0.1874.23±3.541)50.33±3.072)18.65±2.112)3)18.74±1.792)3)0.99±0.1056.64±2.741)40.30±1.192)13.05±1.032)3)12.78±1.172)3)

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與低劑量組比較：3)P<0.01，下表同

表2 珍龍醒腦對大鼠不同時間段腦缺血再灌注損傷Bcl-2表達影響(n=6,)

組別6h12h24h48h72h假手術組模型組珍龍醒腦低劑量組珍龍醒腦中劑量組珍龍醒腦高劑量組6.38±0.0428.03±3.121)56.64±0.972)54.28±1.852)3)58.55±2.42)3)5.27±0.5465.67±3.141)86.86±3.092)117.15±2.732)3)126.53±1.652)3)4.26±0.7898.72±2.951)163.31±4.082)202.56±3.162)3)217.35±5.362)3)6.03±0.1484.23±3.541)150.63±5.242)158.65±2.112)3)178.74±1.792)3)5.99±0.1166.64±2.741)98.30±4.192)103.05±1.032)3)112.78±1.172)3)

表3 珍龍醒腦對大鼠不同時間段腦缺血再灌注損傷Caspase-3表達影響(n=6,)

組別6h12h24h48h72h假手術組模型組珍龍醒腦低劑量組珍龍醒腦中劑量組珍龍醒腦高劑量組4.16±0.3735.03±4.091)26.64±1.262)26.28±1.362)3)28.55±1.522)3)6.04±0.3975.67±3.341)60.86±3.142)57.15±2.602)3)54.70±1.872)3)5.37±0.16148.62±3.971)87.42±3.682)68.46±3.262)3)65.47±3.052)3)4.93±034112.23±4.671)74.53±3.972)58.35±2.452)3)60.74±2.412)3)5.34±0.1689.64±5.301)60.30±2.542)45.05±1362)3)42.33±1.372)3)

3 討 論

局灶性腦缺血再灌注損傷后神經元的死亡包括壞死和凋亡兩種方式，在缺血嚴重的梗死中心區神經元的死亡以壞死為主，而在缺血半暗帶區，存在大量的凋亡細胞。Caspase-3是Caspase 級聯“瀑布下游”最關鍵的凋亡執行蛋白酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用〔4〕。 Bcl-2是目前首個被確認有抑制細胞凋亡作用的因子，可通過多種途徑抑制細胞凋亡的發生〔5〕。Caspase-3 作為Bcl-2 的生理性半胱氨酸蛋白酶，對Bcl-2蛋白具有重要的酶解修飾作用，在細胞發生凋亡時，通過酶切Bcl-2 蛋白來抑制Bcl-2的抗凋亡作用；另一方面，Bcl-2 作為Caspase-3 的上游調控因子，其過度表達可以有效抑制各種因素誘導的Caspase-3 激活和由此產生的細胞凋亡〔6〕。本實驗發現，假手術組大鼠腦皮質和海馬區均可以見到少量的凋亡細胞，這說明神經細胞凋亡在生理情況下也存在。它是維持機體內環境穩定的機制之一。珍龍醒腦能使神經細胞凋亡指數下降，證實了珍龍醒腦對腦缺血損傷的保護作用。腦缺血再灌注損傷可以激活抗凋亡基因Bcl-2的轉錄，增強機體的內源性保護作用。珍龍醒腦膠囊具有上調Bcl-2表達、減少腦缺血病灶周圍Caspase-3陽性細胞表達的能力，提示珍龍醒腦能抑制皮質和海馬神經元凋亡，對腦神經細胞具有保護作用。

1 孫秀華，邱 進，孫美玲，等.珍龍醒腦膠囊治療腦梗死臨床觀察〔J〕.中醫臨床研究，2012;4(24)：13-4.

2 高 偉，張會鮮，孫建云，等.珍龍醒腦膠囊對小鼠腦缺氧及腦缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2012;32(11)：4958-60.

3 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

4 Broughton BR,Reutens DC,Sobey CG.Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia〔J〕.Stroke，2009;40(5)：331-9.

5 林海平，王 永，沈 燕，等.大鼠腦缺血再灌注損傷中細胞凋亡相關調控因子的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2014;9(34)：2589-91.

6 Cooke DT,Hoyt EG,Robbins RC,etal.Over expression of human Bcl-2 in syngeneic rat donor lungs preserves post-transplant function and reduces intragraft caspase activity and interleukin-1 beta production〔J〕.Transplantation,2005；79(7):762-7.

〔2015-06-08修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

江西科技學院校級自然科學基金(ZR13YB07)

1 南昌大學藥學院 2 南昌市第二醫院檢驗科

項穎卿(1976-)，女，碩士，講師，主要從事心腦血管藥理、老年護理研究。

R4

A

1005-9202(2016)23-5835-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.027