膠質瘤相關性癲癇組織高遷移率族蛋白B1的表達

林 嵐 楊 淑 沈云松 蓋雪松 梅 茸 唐 浩

(云南省第一人民醫院神經內科，云南 昆明 650032)

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膠質瘤相關性癲癇組織高遷移率族蛋白B1的表達

林 嵐 楊 淑 沈云松1蓋雪松2梅 茸 唐 浩

(云南省第一人民醫院神經內科，云南 昆明 650032)

目的 探討膠質瘤相關性癲癇致癇組織中蛋白B1的表達。方法 選取72例膠質瘤相關性癲癇患者的膠質瘤標本作膠質瘤并癲癇組，同期行手術治療的70例未伴發癲癇的膠質瘤患者的膠質瘤標本作膠質瘤無癲癇組，同期70例藥物難治性癲癇患者致癇病灶標本作非腫瘤癲癇組，20例接受顱內減壓術治療的患者的腦組織標本作對照組。分析膠質瘤并癲癇組患者癲癇發生情況及膠質瘤病理級別和高遷移率族蛋白B1表達水平的關系、四組高遷移率族蛋白B1表達情況、膠質瘤并癲癇組膠質瘤病理級別對癲癇的影響。結果 膠質瘤并癲癇組患者膠質瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達與膠質瘤病理級別(r=0.154，P<0.05)、癲癇發作頻率(r=0.429，P<0.05)及癲癇持續時間(r=0.254，P<0.05)呈正相關；膠質瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1表達陽性率顯著高于膠質瘤無癲癇組(χ2=8.990，P<0.05)、非腫瘤癲癇組(χ2=19.864，P<0.05)，膠質瘤無癲癇組顯著高于對照組(χ2=32.699，P<0.05)，非腫瘤癲癇組顯著高于對照組(χ2=20.793，P<0.05)；高遷移率族蛋白B1在中低級別中表達水平顯著高于高級別(χ2=11.614，P<0.05)，高遷移率族蛋白B1在高級別膠質瘤中的表達水平與是否并發癲癇有關(χ2=11.445，P<0.05)。結論 高遷移率族蛋白B1在膠質瘤相關性癲癇致癇組織中具有較高表達水平，膠質瘤組織中高遷移率族蛋白B1可能是誘發相關性癲癇的重要因素。

膠質瘤相關性癲癇；致癇組織；高遷移率族蛋白B1

有資料表明，顱內膠質瘤誘發癲癇發生率高達約69.9%，治療膠質瘤相關性癲癇的主要方法為膠質瘤并致癇病灶切除術，且取得了顯著療效〔1，2〕。高遷移率族蛋白B1是一種染色質非組蛋白核蛋白，廣泛分布于機體內的真核細胞中，相關實驗〔3〕證實，高遷移率族蛋白B1與其相關受體Toll樣受體4(TLR4)在癲癇大鼠模型的發病及復發中活躍度較高，且人體顳葉癲癇患者海馬中TLR4、高遷移率族蛋白B1表達的組織病理學模型與癲癇大鼠模型極其相似，因此推測高遷移率族蛋白B1與其受體糖基化終產物受體(RAGE)、TLR4等可經免疫反應引發癲癇。此外，近些年有相關學者研究〔4〕指出，高遷移率族蛋白B1在膠質瘤、結腸癌等腫瘤疾病中具有較高表達水平。本研究旨在進一步探討高遷移率族蛋白B1在膠質瘤相關癲癇組織的表達意義。

1 對象及方法

1.1 對象 選取2010年6月至2016年2月在我院神經外科行手術治療的72例膠質瘤相關性癲癇患者的膠質瘤標本作膠質瘤并癲癇組，另選取同期行手術治療的70例未伴發癲癇的膠質瘤患者的膠質瘤標本作膠質瘤無癲癇組，70例藥物難治性癲癇患者致癇病灶標本作非腫瘤癲癇組，20例接受顱內減壓術治療的患者的腦組織標本作對照組。四組患者性別、年齡等基本信息對比無統計學差異(P>0.05)，具有研究價值，且本研究經我院倫理委員會審核同意。

1.2 免疫組化方法 對標本行包埋處理，以3.0 μm厚度對其進行連續切片，隨后將其放置于載玻片上(經防脫劑預處理)。以檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)作修復液，通過微波加熱修復法對抗原實施修復處理，完成修復后滴加高遷移率族蛋白B1單克隆抗體；利用微波高溫對切片行加熱處理(2.0 min左右)，待其溫度上升至90.0℃～95.0℃出現微小波動時，立即調至保溫模式(8.0 min左右)，待切片溫度恢復至室溫水平時，通過蒸餾水對其進行2次沖洗，隨后將其放入3.0%H2O2液體內，9.0～10.0 min后再次蒸餾水行兩次沖洗。滴加高遷移率族蛋白B1單克隆抗體并在4.0℃環境下過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，滴加生物素標記二抗后于室溫條件下20.0 min孵育處理；PBS沖洗，加入辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，隨后于室溫條件下行15.0 min孵育處理。采用DAB顯色劑對切片行顯色操作，清洗后以蘇木精復染；通過乙醇實施常規脫水及二甲苯透明處理，以中性樹膠對其行封片處置，并通過顯微鏡對其進行觀察。

1.3 免疫組化染色評估 高遷移率族蛋白B1免疫染色情況依據染色程度和免疫組化染色率進行綜合評定。選取各切片中免疫反應最強烈的區域，并采用高倍視鏡(×400)對切片中5個非重復視野進行觀察，統計高遷移率族蛋白B1染色細胞數量，計算染色率〔染色率=(染色細胞數/總細胞數)×100.0%〕。染色率評分標準〔5〕：染色率>75.0%為4分，50.0%<染色率<74.0%為3分，25.0%<染色率<49.0%為2分，染色率≤24.0%為1分，無染色細胞為0分。免疫染色程度評分參照細胞質染色程度進行評定〔6〕：深黃色為2分，淺黃色為1分，無色為0分。最終得分為染色率評分與免疫染色程度評分之和，并設定：4～6分為高表達，以“**”表示；1～3分為低表達，以“*”表示；0分為陰性，以“-”表示。

1.4 統計學方法 應用SPSS20.0軟件，兩獨立樣本均數的比較采用t檢驗，計數資料組間分布采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 膠質瘤并癲癇組患者癲癇發生情況及膠質瘤病理級別和高遷移率族蛋白B1表達水平的關系 膠質瘤并癲癇組患者膠質瘤組織中高遷移率族蛋白B1表達與膠質瘤病理級別(r=0.154，P<0.05)、癲癇發作頻率(r=0.429，P<0.05)及癲癇持續時間(r=0.254，P<0.05)呈正相關。見表1。

表1 膠質瘤并癲癇組患者癲癇發生情況及膠質瘤病理級別與高遷移率族蛋白B1表達水平的關系(n)

病理因素n低表達高表達r值P值膠質瘤病理級別 中、低級5631250.154<0.05 高級16313癲癇發作頻率(個月) >35313400.429<0.05 ≤319172癲癇持續時間(min) >53710270.254<0.05 ≤5352411

2.2 四組高遷移率族蛋白B1表達情況對比 膠質瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1表達陽性率(100%)顯著高于膠質瘤無癲癇組(85.71%)(χ2=8.990，P<0.05)、非腫瘤癲癇組(75.71%)(χ2=19.864，P<0.05)，膠質瘤無癲癇組顯著高于對照組(20.00%)(χ2=32.699，P<0.05)，非腫瘤癲癇組顯著高于對照組(χ2=20.793，P<0.05)。

2.3 膠質瘤并癲癇組膠質瘤病理級別對癲癇的影響 膠質瘤并癲癇組高遷移率族蛋白B1在中低級別中表達水平(100.00%)顯著高于高級別(20.00%)(χ2=11.614，P<0.05)，高遷移率族蛋白B1在高級別膠質瘤中的表達水平與是否并發癲癇有關，并發癲癇組為20.00%，非癲癇組為92.11%(χ2=11.445，P<0.05)。

3 討 論

據報道，約29.4%的癲癇患者遵從醫囑堅持長期定時定量用藥治療，但病情仍難以得到完全控制，此類癲癇在臨床醫學中被稱為難治性癲癇〔7〕。外科手術是治療難治性癲癇的主要措施之一，但少數難治性癲癇患者難以明確其發病原因，如顱內血管畸形、外傷、顱內腫瘤等，其中膠質瘤是發病率較高的腫瘤之一〔8〕。有文獻〔9〕指出，神經化學物質及腫瘤細胞成分的組成對癲癇發作具有決定性作用。膠質瘤瘤周組織微環境和形態學的變化均可誘發癲癇，如腫瘤灶的局部刺激、腫瘤中血流減少、血腦屏障受損、突觸囊泡改變、神經元異常遷移及谷氨酸濃度失衡等，這些變化均可對神經化學物質、細胞結構及神經網絡的改變產生重要影響〔10〕。機體血腦屏障受損導致血清中谷氨酸等相關致癇物質到達瘤周部位時，可使瘤周組織的興奮性神經遞質顯著增加，促進膠質細胞大量聚集；同時，瘤周角質細胞被激活后缺乏功能性角質細胞特有的轉運體GLAST、GLT-1，從而無法對谷氨酸進行有效清除。

相關實驗〔11〕證實，癲癇大鼠模型海馬組織中高遷移率族蛋白B1表達水平過高時，可加劇其損傷狀態，同時還可導致海馬組織中P-糖蛋白(P-gp)過量表達，進而提高癲癇發作的易感性。另有研究〔12〕指出，隨時間延長，高遷移率族蛋白B1在Sombati癲癇細胞中的表達量會不斷增加，在癲癇的生理病理中發揮重要作用。本研究顯示，高遷移率族蛋白B1在致癇灶組織中的表達情況可能直接相關于癲癇發病，與以往相關研究結果〔13〕一致，高遷移率族蛋白B1不僅在膠質瘤組織中表達較高，同時其表達情況還與膠質瘤的病理級別存在一定相關性，由此可以推測，高遷移率族蛋白B1在膠質瘤非癲癇患者膠質瘤組織內的表達水平顯著高于正常腦組織。本研究還顯示：高遷移率族蛋白B1對低病理級別膠質瘤患者是否會并發癲癇有重要影響。分析其原因可能是膠質瘤組織可生成大量高遷移率族蛋白B1，而高遷移率族蛋白B1可與其RAGE、TLR4等受體共同形成異常放電通路，從而構成癲癇發作的基礎；低病理級別的膠質瘤病程相對較長，其生成的高遷移率族蛋白B1進入細胞外環境后可加劇機體炎性反應，進而構成瘤周致癇灶；而腫瘤性病變中的免疫反應、蛋白質表達、膠質細胞的酶及神經元異常均可對腦功能造成影響，繼而引發癲癇。

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〔2016-05-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

1 云南省第一人民醫院檢驗科 2 云南省第一人民醫院神經外科

林 嵐(1969-)，女，副主任醫師，主要從事臨床神經病學、癲癇病學方面的研究。

R742.1

A

1005-9202(2016)23-5837-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.028