光敏劑喜泊分對H22肝癌小鼠移植瘤的放射增敏效果

劉 偉 徐 鑫 王英芳 許文華

(河北中醫學院護理學院，河北 石家莊 050200)

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光敏劑喜泊分對H22肝癌小鼠移植瘤的放射增敏效果

劉 偉 徐 鑫1王英芳 許文華

(河北中醫學院護理學院，河北 石家莊 050200)

目的 觀察光敏劑喜泊分對H22肝癌小鼠移植瘤的放射增敏效果。方法 建立H22肝癌細胞小鼠移植瘤模型，將荷瘤小鼠隨機分為對照組、放療1組、聯合治療1組、放療2組、聯合治療2組、放療3組、聯合治療3組，觀察第14天瘤體積、抑瘤率、增敏系數、小鼠生存時間、病理、細胞凋亡等指標。結果 喜泊分聯合放療能夠抑制小鼠移植瘤生長，尤其聯合治療2組，第14天瘤體積明顯減小、增敏系數>1，有最佳增敏效果，能夠明顯延長小鼠生存時間，病理HE染色顯示，聯合治療2組腫瘤細胞壞死數量最多，壞死范圍最大，流式細胞儀檢測細胞凋亡顯示聯合治療2組凋亡率最高。結論 喜泊分聯合放療可以有效減小瘤體積，提高抑瘤率，延長小鼠生存時間，促使細胞凋亡，具有良好的放射增敏效果。

肝癌；喜泊分；抑瘤率；放射增敏；凋亡

目前治療肝癌的方法不斷改進，主要有手術切除、放化療、肝臟移植、細胞免疫等治療方法，但總體來說，對肝癌的治療仍然是很局限的，在預防方面和治療手段的選擇上都不太成熟〔1，2〕。本實驗通過對H22肝癌細胞小鼠移植瘤模型的研究，測試國產光敏劑血卟啉衍生物喜泊分對X線照射的抑瘤增敏作用，闡明其與放療結合增加射線對肝癌放射敏感性的潛在意義及增敏程度。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠H22腹水型肝癌細胞株，由河北醫科大學提供；6周齡健康雄性SPF級昆明小鼠，體重20～25 g，購于河北醫科大學實驗動物中心；DMEM 培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；電子分析天平JA5003(上海精科水平廠)；CO2恒溫培養箱 TC2323(美國SHELDON公司)；普通光學顯微鏡 BX-50(日本Olympus)；細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技公司；放療設備由河北省人民醫院腫瘤放療科提供，直線加速器：SIMENS PRIMUS型。

1.2 細胞株復蘇及傳代培養 將小鼠H22肝癌細胞從液氮中取出，置入37℃水浴中復蘇，置于DMEM培養液中離心，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下恒溫培養箱中培養。根據顯微鏡下細胞生長狀況進行細胞換液與傳代，每2～3 d換液1次。待細胞鋪滿80%培養瓶底時，1∶3分瓶傳代。

1.3 小鼠腹水傳代及模型建立 體外培養傳代生長良好的H22小鼠肝癌細胞以無菌生理鹽水配成濃度為1.0×107/ml，取健康昆明小鼠3只，腹部用75%酒精嚴格消毒，腹腔內接種腫瘤細胞懸液0.5 ml/只，接種后8 d可見小鼠腹部增大，抽取小鼠腹水，用生理鹽水稀釋至5×106個瘤細胞/ml后小鼠腹腔3次傳代，腹水形成后，于無菌條件下收集腫瘤細胞生長良好的腹水，參照有關文獻〔3，4〕，臺盼藍拒染實驗細胞生存率>99%、HE 染色見大量腫瘤細胞時可用。用生理鹽水將腹水稀釋至約 2×106個瘤細胞/ml，取健康昆明小鼠80只，75%酒精消毒小鼠右前肢皮膚后皮下注射腫瘤細胞懸液0.2 ml，可見局部有黃豆大小皮丘隆起，觀察1 min，如無瘤液溢出，送回飼養籠。接種后第3天注射部位可觸及腫瘤結節，第7天結節平均體積可達到0.8 cm左右，視為模型制作成功，模型制作成功率為100%。選取腫瘤長徑為5.5～6.5 mm結節形狀較規則、與肌肉皮膚無粘連小鼠用于實驗。

1.4 荷瘤小鼠隨機分組及處理 將H22皮下移植肝癌荷瘤小鼠按隨機數字法分為對照組、放療1組(5 Gy組)、聯合治療1組(5 Gy+15 mg/kg喜泊分組)、放療2組(10 Gy組)、聯合治療2組(10 Gy+15 mg/kg喜泊分組)、放療3組(15 Gy組)、聯合治療3組(15 Gy+15 mg/kg喜泊分組)共7組，每組10只，共80只予背部皮膚墨水標記，分籠飼養。具體處理如下。

1.5 觀察腫瘤體積變化、計算腫瘤生長抑制率并繪制腫瘤生長曲線 治療開始后動態觀察各組腫瘤外觀、質地、活動度等生長情況。用游標卡尺每隔1 d測量各處理組腫瘤的最長徑(LD)及最短徑(SD)并詳細記錄，直至治療開始后第14天。按照Steel經驗公式計算腫瘤體積如下：腫瘤體積(mm3)V=LD×SD2/2。根據各組平均體積繪制腫瘤生長曲線。

1.6 腫瘤生長延緩時間與增敏系數 計算腫瘤生長3倍倍增時間(TGT3)：腫瘤體積生長至放射治療前3倍所需時間為3倍倍增時間。腫瘤生長延遲時間(TGD)：不同實驗組與空白對照組的TGT3之差為腫瘤生長延遲時間。增敏系數(EF)=給藥照射組TGD/單純照射組TGD，EF>1表示有放射增敏效應，EF>1.6說明有較好的放射增敏效應。

1.7 荷瘤小鼠生存期觀察并繪制生存曲線 治療第14天各組剩余6只荷瘤小鼠不處死，繼續常規喂養，讓其無干預病死，觀察各組小鼠生存期，計算其生命延長率，并根據生存時間繪制小鼠生存曲線。生命延長率計算公式如下：生命延長率=(治療組平均生存天數-對照組平均生存天數)/對照組平均生存天數×100%。

1.8 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學檢查 將小鼠腫瘤組織保存、固定、浸蠟、包埋，制作成蠟塊，連續切片制作成厚度約5 μm 的石蠟切片，HE 常規染色，顯微鏡下觀察各組切片腫瘤組織壞死情況。

1.9 流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡情況 將每組剝離腫瘤部分組織剪成黃豆大小腫瘤組織小塊(約8×8 mm3大小)，置于于70%酒精4℃冰箱中保存，檢測時將組織取出(出血壞死部分切除)研磨-過濾-離心-棄上清液-上機分析，處理后上流式細胞儀檢測腫瘤組織凋亡情況。

1.10 統計學分析 采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析、LSD-t檢驗、非參數檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法。

2 結 果

2.1 各組第14天腫瘤體積及生長抑制率 各治療組瘤體積控制及腫瘤生長抑制率均優于對照組(P<0.05)，以聯合治療2組效果最明顯，見表1，圖1。

2.2 腫瘤生長延緩時間與EF 3個聯合治療組EF均大于1，使單獨放療的敏感性提高1.722 5倍，聯合治療2組>聯合治療1組>聯合治療3組。說明3組均能延緩腫瘤生長，具有放療增敏作用。其中聯合治療2組EF最大。見表2。

組別瘤體積(mm3)生長抑制率(%)對照組5827.1±191.104650放療1組4400.7±311.0284224.481)聯合治療1組4098.0±245.665081)2)29.671)2)放療2組3797.6±212.754011)34.831)聯合治療2組2923.9±177.38561)2)49.821)2)放療3組2962.9±202.122321)49.151)聯合治療3組2798.9±171.118191)52.121)

與對照組比較：1)P<0.05；與同劑量放療組比較：2)P<0.05

圖1 各組移植瘤生長曲線

組別TGT3(d)TGD(d)EF對照組5.110-放療1組7.0421.932-聯合治療1組7.92092.81091.4549放療2組8.79593.6859-聯合治療2組11.458956.348951.7225放療3組12.102466.992-聯合治療3組13.231368.121361.16152

2.3 荷瘤小鼠生存期及生命延長率 各治療組均能提高生命延長率，聯合治療2組效果最明顯，見表3。

組別平均生存天數(d)生命延長率(%)對照組18.00±1.825740放療1組22.00±2.1602522.201)聯合治療1組27.00±2.449491)50.001)放療2組30.75±1.50001)70.831)聯合治療2組43.25±2.753791)2)140.281)2)放療3組39.50±2.081671)119.401)聯合治療3組37.00±2.708011)105.601)

與對照組比較：1)P<0.05；與其他各組比較：2)P<0.05

2.4 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學檢查 處理組小鼠H22實體瘤細胞形態鏡下觀察，與對照組比較，出現腫瘤細胞減少，壞死，染色質固縮濃染，有的呈半月形，緊貼于核膜周邊，部分細胞裂解為碎片狀，以聯合治療2組最為明顯，腫瘤細胞壞死數量最多，壞死范圍最大。見圖2。

2.5 流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡情況 放療組、聯合治療1組、放療2組、聯合治療2組、放療3組、聯合治療3組凋亡率分別為7.72%、17.73%、26.39%、32.89%、31.84%、31.67%，較對照組凋亡率(3.37%)增加，均出現亞二倍體峰(凋亡峰)，且聯合治療2組凋亡峰值最高。

圖2 各組移植瘤病理觀察(HE，×400)

3 討 論

目前手術切除仍是肝癌的治療首選方案，然而，多數肝癌患者就診時已屬中晚期，手術難以完全切除。即使根治性切除，5 年存活率僅為50%～62.7%，10年存活率為6.3%〔5〕，術后5年復發率在50%以上〔6〕，且仍以每年25%的速度遞增，復發高峰多在術后1～2年〔7〕。20世紀90年代中期后三維適形放療(3DCRT)和調強適形放療(IMRT)等現代放療技術逐漸成熟，為放療在肝癌治療中的應用提供了新的機會和可能性。關于采用3DCRT和IMRT技術治療不能手術切除的原發性肝癌的研究層出不窮，局限于肝內的原發性肝癌患者行放療結合介入治療3年生存率為25%～30%〔8〕。國外文獻報道對同時存在肝內和肝外病灶(肺、腎上腺、軟組織轉移)者，每位患者平均3. 5個病灶，使用螺旋斷層放療中位生存期為12. 3個月，接受放療的病灶1 年內局部控制率為79%，且沒有Ⅳ級的不良反應〔9〕。放射治療已成為治療肝癌的重要手段之一。

放射治療是在保存器官的情況下用來控制局部腫瘤的一種治療手段〔10〕。60%～70%以上腫瘤病人在病情的不同階段需要作放射治療。單獨的放療只對輻射敏感的部分腫瘤有比較好的療效，但是大部分腫瘤對輻射并不十分敏感〔11～13〕。放射增敏劑可提高腫瘤細胞對放療的敏感性及放射線對腫瘤細胞的殺傷率，增強放療療效，成為腫瘤放射治療的一個重要研究課題。放射增敏劑一詞現已被輻射的化學修飾劑所取代〔14～18〕，然而目前還沒有令人滿意的放療增敏藥物應用于臨床。

本研究的光敏劑喜泊分易溶于水，便于給藥；可被電磁波激發發揮殺傷癌細胞的作用；同時具有對腫瘤的選擇性濃集作用；且對重要臟器無明顯毒副反應，預期對腫瘤有更好的放射增敏效果。其腫瘤放射增敏作用的研究則是本次實驗的重點。因其應用尚未被廣泛認可，在進行該研究時有必要先采用動物實驗的方法探索合適的聯合方式及安全的用藥劑量。

本實驗結果提示喜泊分可以促使細胞從放射最不敏感的S 期進入G2/M期，并將細胞阻滯在放射敏感性最高的G2/M期，使腫瘤細胞更易進入X射線誘導的凋亡途徑，具有良好的放射增敏效果。

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〔2014-10-17修回〕

(編輯 趙慧玲/曹夢園)

河北省科技計劃項目(152777124)；河北省中醫藥管理局科研計劃項目(2014159)；河北中醫學院青年基金項目(17)

1 河北省人民醫院

許文華(1980-)，女，碩士，講師，主要從事護理學及教育學研究。

劉 偉(1980-)，女，碩士，講師，主要從事腫瘤綜合防治研究。

R73；R592

A

1005-9202(2016)23-5841-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.030