黏著斑激酶在鼻咽癌細胞系6-10B中的表達及其對Bcl-2和Bax表達的影響

王鳳琴 章許晶

(武漢市第三人民醫院耳鼻喉科，湖北 武漢 430060)

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黏著斑激酶在鼻咽癌細胞系6-10B中的表達及其對Bcl-2和Bax表達的影響

王鳳琴 章許晶

(武漢市第三人民醫院耳鼻喉科，湖北 武漢 430060)

目的 探討黏著斑激酶(FAK)在鼻咽癌細胞6-10B中的表達及其對凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的影響。方法 鼻咽癌細胞6-10B培養后利用RNA干擾(RNAi)技術下調FAK在6-10B中的表達水平，通過RT-PCR、Real-time PCR、Western印跡檢測其干擾效率，通過Western印跡檢測干擾后凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達水平，通過Hoechst染色觀察細胞凋亡形態。結果 干擾后 FAK在鼻咽癌細胞6-10B中表達量較低、下調明顯(P<0.05)；鼻咽癌細胞系6-10B干擾FAK后，Bcl-2和Bax的表達量發生較明顯改變(P<0.05)；Hoechst染色結果顯示干擾后細胞出現明顯的凋亡形態。結論 干擾FAK后促進鼻咽癌細胞凋亡，提示可以通過下調FAK表達水平促進腫瘤細胞凋亡，為鼻咽癌的基因治療提供新的思路。

黏著斑激酶；鼻咽癌細胞；RNA干擾；凋亡相關蛋白

鼻咽癌(NPC)是一種具有區域特性的惡性腫瘤，發病過程與環境致癌因素、遺傳易感性和EB病毒相關〔1〕。黏著斑激酶(FAK)是一種細胞質非受體型蛋白酪氨酸激酶，屬于黏附斑復合物家族。FAK在貼壁細胞中起抗凋亡作用，具體的分子機制不很清楚〔2〕。但有研究表明FAK對腫瘤增殖、生存、遷移、侵襲、轉移和血管形成等行為起著重要的調控作用〔3，4〕，因此被認為是腫瘤發生進程的關鍵分子之一，可能成為腫瘤治療的靶點。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA介導的能特異性地靶向特定序列的mRNA，并進一步促進其發生降解，從而導致基因沉默的一種方式〔5〕。本實驗觀察FAK基因表達下調對NPC細胞凋亡相關蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與試劑 NPC細胞系6-10B由本實驗室保存，RPMI1640培養基購自美國Sigma公司；胎牛血清購自以色列Biolnd公司；胰蛋白酶購自研科生物公司；一抗及二抗購自武漢三鷹公司；細胞培養板購自Costar公司；逆轉錄試劑盒購自abm公司；qPCR 試劑盒(SYBR Green I)購自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Pierce Chemical公司，5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液、SDS、吐溫緩沖液(Tris)、甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、30%Acr-Bis(29∶1)、Glycine、Tween20、過硫酸銨、脫脂奶粉購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；D-Hank緩沖液為自行配制。

1.1.2 儀器 CO2培養箱購自美國Forma公司；高速冷凍離心機為Heraeus公司產品；實時熒光定量PCR儀為美國Bio-Rad公司產品；T1 Thermocycler PCR儀為Biometra公司產品；RNA濃度測量儀Nanodrop2000購自Thermo Scientific公司；光學顯微鏡和倒置顯微鏡為Olympus公司產品；-80℃冰箱為中國海爾集團產品；板式酶標儀購自北京市新風機電技術公司；電泳儀及轉膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.1.3 引物 引物序列:GAPDH上游引物：GAGATCCCTCCAAAATCAAGTG，下游引物：GAGTCCTTCCACGATACCAAAG；產物長度282 bp，退火溫度58℃,循環數30個；siRNA上游引物：GCGAAATCCATAGCAGGCCACTATAGTGAGTCGTATTACC，下游引物：ACGTGGCCTGCTATGGATTTCTATAGTGAGTCGT ATTACC，產物長度127 bp，退火溫度55℃，循環數30個；FAK上游引物：TGGTGCAATGGAGCGAGTATT，下游引物：CAGTGAACCTCCTCTGACCG，產物長度279 bp，退火溫度60℃，循環數38個。由銳博公司合成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA制備 Non-target siRNA作為陰性對照。特異性干擾FAK的靶序列所對應的mRNA序列siFAK：5′-GCGAAATCCATAGCAGGCCACTATAGTGAGTCGTATTACC-3′;Non-targeting siRNA的靶序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3。

1.2.2 siRNA轉染NPC細胞系6-10B 將生長在RPMI1640(10%小牛血清)中的NPC細胞系6-10B，以106的密度接種于六孔板中，24 h后觀察細胞密度達60%～80%。準備轉染混合液：A液(100 μl)：3 μl lipofectamin RNAiMAX+97 μl Opti-MEM；B液(100 μl)：5 μl siRNA(終濃度為100 nmol/L)+95 μl Opti-MEM。A、B液混合，室溫靜置12 min，加入3 500 μl全血清培養基，混合后將液體加入培養基內，左右移動，使其充分混勻細胞表面，培養箱中培養6 h后換成完全培養基，繼續培養。72 h后收集細胞，抽提RNA和蛋白，檢測干擾效果，進一步分析FAK的表達水平及其對凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響。

1.2.3 細胞總RNA的提取 制備總RNA的器皿需要去RNase處理：玻璃器皿洗凈后，180℃烤箱烤8 h左右；塑料制品用含0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的無菌水浸泡24 h，高壓滅菌，烤干備用。

1.2.4 RNA的制備 取細胞1瓶，約1×106個細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.2，0.01 mol/L)洗滌2次，加入TRIzol 1 ml，反復吹打均勻；置冰上8 min，加入氯仿200 μl，上下顛倒3次，冰上靜置8 min，12 500 r/min，4℃離心20 min，吸取上層液體，加異丙醇500 μl，置于-20℃靜置30 min，13 000 r/min 4℃離心15 min，75%乙醇洗滌，用無酶水溶解，-80℃保存。

1.2.5 總RNA的鑒定 1.2%瓊脂糖凝膠，電泳，凝膠成像系統拍照保存，測定濃度。

1.2.6 兩步法差異RT-PCR 按abm說明書進行。反應條件：RT-PCR：42℃ 50 min，85℃ 5 min，-20℃保存；qPCR：25℃ 10 min，42℃ 15 min，置-20℃保存。根據每個樣本RNA濃度不同，取1～5 μl不等。

1.2.7 PCR反應 RT-PCR反應體系：10×Mix(10 μmol/L)2 μl，引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA 1 μl ，滅菌雙蒸水16 μl，總體系20 μl。反應條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30～34個循環，72℃ 10 min。

qPCR反應體系：SYBR Green(2×)10 μl，引物(10 μmol/L)1 μl，cDNA 1 μl，滅菌雙蒸水8 μl，總體系20 μl。每個樣品同時做FAK和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，重復3個孔，反應條件：第一階段：95℃ 10 s，1個循環；第二階段：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環。溶解曲線分析由PCR儀自動完成。

1.2.8 免疫印跡法檢測相關蛋白表達

1.2.8.1 蛋白樣品的獲得 (1)蛋白裂解液的配制(100 μl體系)，100×蛋白酶抑制劑1 μl，蛋白裂解液加至100 μl。(2)蛋白抽提，用預冷的D-Hank液清洗3次轉染72 h后的細胞，每一個孔加入蛋白裂解液，將其置于冰上裂解30 min，用細胞刮刀將孔中細胞小心刮下并收集到1.5 ml EP管中，在4℃ 離心機中以12 000 r/min的速度離30 min，離心完畢后將其取出置于冰上，分裝備用。

1.2.8.2 BCA法蛋白定量 采用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit進行。

1.2.8.3 蛋白變性 按比例加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，置于金屬浴中95℃孵育10 min后立即置于冰上冷卻，最后放于-20℃冰箱保存備用。

1.2.8.4 Western印跡分析 (1)電泳：根據待檢測蛋白質的大小選擇合適濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每泳道上樣40 μg，先70 V電泳30 min，再130 V電泳至溴酚藍染料跑出膠后停止電泳，冰上進行。(2)轉膜：斷掉電源，取出電泳板，根據樣品數量及蛋白分子量大小剪下合適大小的膠，用尺子量好長和寬后放置于盛有轉膜液的平皿中。根據膠的尺寸大小裁剪合適孔徑的聚偏氟乙烯(PVDF)膜以及專用濾紙，按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙順序放置，將轉膜板卡緊，放入轉膜槽中，打開電源100 V恒壓轉膜1～2 h(根據蛋白的大小不同而不同，蛋白分子量大的轉膜時間久)。(3)封閉：5%脫脂牛奶，用TBST稀釋，室溫封閉1 h。(4)一抗孵育：按照抗體說明書用TBST將一抗稀釋到適合的比例。 (5)洗膜：TBST液體洗滌3次，每次10～15 min。(6)二抗孵育：根據實驗所用一抗的種屬選擇對應的二抗，并用TBST將二抗稀釋到適合的比例，并將其置于搖床上室溫孵育1 h。(7)洗膜：同上。(8)顯影：在膜表面滴入適量的HRP化學顯影液，使之覆蓋膜的整個表面，在凝膠成像系統中拍照保存。

1.3 Hoechst染色觀察細胞凋亡形態 將生長在RPMI1640(10%小牛血清)中的鼻咽癌細胞系6-10B，以105的密度接種于六孔板中，24 h后觀察細胞密度達50%左右，PBS洗3次，加入500 μl Hoechst(1∶2 000)，避光孵育15 min，PBS洗滌，熒光顯微鏡下拍照。

1.4 統計學分析 計量資料組間比較行t檢驗。

2 結 果

2.1 RT-PCR、qPCR分析轉染的細胞中FAK基因在mRNA水平的表達 分別抽提6-10B shFAK和6-10B-shvector細胞總RNA，逆轉錄后用于PCR檢測，所用引物為跨內含子設計，擴增片段大小為279 bp。

以內對照GAPDH為參照，6-10B shFAK與6-10B-shvector細胞相比，6-10B shFAK細胞中可檢測到FAK的表達明顯下調，qPCR顯示下調達80%以上。

2.2 兩組細胞的總蛋白 shFAK 組中Bcl-2表達下調，Bax表達水平明顯上調，Bax/Bcl-2比值上升，促進細胞凋亡。見圖1，表1。

表1 蛋白表達量的灰度分析

基因灰度值干擾前干擾后t值P值FAK613620199534124.1570.000Bcl-226426716045920.1660.002Bax16806873621257.1260.000

圖1 Western印跡檢測干擾FAK后凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達水平

2.2 Hoechst染色結果 干擾FAK后藍色熒光明顯增強，并且細胞核出現明顯固縮，甚至出現凋亡小體(圖2)。

圖2 Hoechst染色結果顯示干擾FAK后細胞核形態改變

3 討 論

目前的研究發現，在包括食管癌、肺癌、乳腺癌和結直腸癌等多種腫瘤組織中，FAK的核酸及蛋白水平處于高表達和過度激活的狀態〔6〕。FAK表達異常升高與腫瘤細胞增殖、逃避凋亡、轉移和侵襲具有密切關系，通過抑制FAK表達或許能成為抑制腫瘤惡性表型發生的關鍵〔7〕。因此，抑制FAK的表達有望成為腫瘤基因治療的新熱點。Tavora等〔8〕研究表明，在內皮細胞中沉默FAK 對血管本身的功能沒有明顯影響，但是在血管周的腫瘤細胞和阿霉素放射治療老鼠中誘導細胞凋亡增加，增殖減少。許呂宏等〔9〕的研究表明：FAK基因的表達能夠顯著提高白血病細胞對化療藥物的敏感性，其結果在動物體內實驗中也得到了充分證實。提示靶向降低FAK 基因表達水平有望成為治療惡性腫瘤的新方法。劉華聯等〔10〕的研究表明沉默FAK基因可以促使失巢凋亡，從而使舌癌細胞失巢凋亡抗性發生逆轉，是一個潛在的抗舌癌轉移分子治療的靶點。

Bcl-2是一種與凋亡有關的基因，也是最為主要的調控細胞發生凋亡的基因。Bcl-2對細胞凋亡起抑制作用，Bax對細胞凋亡起促進作用〔4〕。Bax可以和Bcl-2形成同源或異源二聚體來共同調節細胞凋亡過程。Bcl-2與細胞凋亡存在負相關，而Bax則情況相反〔11，12〕。

FAK在NPC組織中的表達鮮有報道。筆者認為，抑制FAK基因的表達可促進NPC細胞凋亡。

1 Xu T，Tang J，Gu M，etal.Recurrent nasopharyngeal carcinoma：a clinical dilemma and challenge〔J〕.Curr Oncol，2013；20(5)：e406-19.

2 Sulzmaier FJ，Jean C，Schlaepfer DD.FAK in cancer：mechanistic findings and clinical applications〔J〕.Nat Rev Cancer，2014；14(9)：598-610.

3 Zimman A，Chen SS，Komisopoulou E，etal.Activation of aortic endothelial cells by oxidized phospholipids：a phosphoproteomic analysis〔J〕.J Proteome Res，2010；9(6)：2812-24.

4 Miller NL，Kleinschmidt EG，Schlaepfer DD.RhoGEFs in cell motility：Novel links between Rgnef and focal adhesion kinase〔J〕.Curr Mol Med，2014；14(2)：221-34.

5 Chapman NM，Houtman GC.Functions of the FAK family kinases in T cells：Beyond actin cytoskeletal rearrangement〔J〕.Immunol Res，2014；59(1)：23-34.

6 張學彥，呂成倩，杜 冰，等.FAK 在食管癌組織中的表達及臨床意義〔J〕.胃腸病學和肝病學雜志，2014；23(8)：866-9.

7 張柯晴，呂坤聚，朱君祥.FAK、NF-κB、p65 及 VEGF-C 在肺鱗癌和肺腺癌中的表達及意義〔J〕.臨床肺科雜志，2015；20(4)：603-6.

8 Tavora B，Reynolds LE，Batista S，etal.Endothelial-cell FAK targeting sensitizes tumours to DNA-damaging therapy〔J〕.Nature，2014；514(7520)：112-6.

9 許呂宏，方建培.FAK 基因沉默誘導白血病細胞凋亡〔J〕.中國病理生理雜志，2010；26(7)：1352-5.

10 劉華聯，江宏兵，承翼南，等.FAK 基因沉默促進舌癌細胞失巢凋亡及抑制轉移的實驗研究〔J〕.交通醫學，2015，29(1)：16-23.

11 Zhang Z，Knoepp SM，Ku H，etal.Differential expression of FAK and Pyk2 in metastatic and non-metastatic EL4 lymphoma cell lines〔J〕.Clin Exp Metastasis，2011；28(6)：551-65.

12 陳玉英，陳克力，潘 鳳，等.結直腸癌中FAK、FAK pY 397、Akt、NF-κB表達及相關性研究〔J〕.臨床腫瘤學雜志，2009；14(3)：199-202.

〔2015-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

章許晶(1984-)，女，碩士，住院醫師，主要從事耳鼻喉科疾病研究。

王鳳琴(1971-)，女，主管護師，主要從事耳鼻喉科疾病護理研究。

R739.6

A

1005-9202(2016)23-5844-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.031