5種腫瘤干細胞標志物在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

蔡傳書 王培榮 黃 雄 呂文龍

(福建醫科大學附屬第一醫院放療科，福建 福州 350005)

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5種腫瘤干細胞標志物在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

蔡傳書 王培榮 黃 雄 呂文龍

(福建醫科大學附屬第一醫院放療科，福建 福州 350005)

目的 探討CD133、滋養層細胞表面抗原-2(TROP-2)、CD44、三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2(ABCG2)及神經營養因子受體p75(p75NTR)五種腫瘤干細胞(CSC)標志物在非小細胞肺癌(NSCIC)組織中的表達及其與臨床病理參數間的關系。方法 選取80例NSCLC組織、33例癌旁組織、28例正常組織為研究對象，采用免疫組化法檢測各組織中CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR蛋白表達的差異，分析其與NSCLC患者病理參數的相關性。結果 (1)CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR在NSCLC組織中的陽性率分別為80.00%、87.50%、50.00%、62.50%、68.75%；在癌旁組織中的陽性率分別為6.06%、30.30%、15.15%、21.21%、12.12%；在正常組織中的陽性率分別為46.43%、10.71%、21.43%、21.43%、21.43%，各指標在不同組織間的陽性率比較差異均有統計學意義(P<0.05)。(2)隨著細胞分化程度的降低，NSCLC組織中的CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR的陽性率均呈上升趨勢(P<0.05)，CD133、TROP-2陽性率與NSCIC患者年齡、淋巴結轉移、TNM分期有關(P<0.05)，ABCG2及p75NTR陽性率與NSCIC患者年齡及遠處轉移有關(P<0.05)。結論 NSCLC組織中CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR的表達水平異常，且均與NSCLC腫瘤細胞分化密切相關。

非小細胞肺癌；腫瘤干細胞

腫瘤干細胞(CSC)是腫瘤組織中具有自我更新、增殖以及多向分化的腫瘤細胞，也是腫瘤不斷生長、轉移與復發根源〔1〕。CD133是一種經典的CSC標志物〔2，3〕，眾多研究表明，滋養層細胞表面抗原-2(TROP-2)、CD44、三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2(ABCG2)及神經營養因子受體p75(p75NTR)等也具有CSC特性，可以作為CSC篩選標志物，與腫瘤生長、轉移、侵襲息息相關〔4，5〕。本研究采用免疫組化法檢測CSC標記物CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR在非小細胞肺癌(NSCLC)、癌旁及正常組織中的表達情況，分析其與臨床病理參數的相關性。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 抽選2010年3月至2015年7月在我院行手術切除術的80例NSCLC患者，留取手術組織標本存檔。納入標準：①臨床上均經組織學檢查，確診為NSCLC；②患者術前均未予以放、化療治療或者其他抑制腫瘤治療，排除其他類型肺癌患者。男30例，女50例，年齡44～73歲，平均(62.8±8.6)歲。取33例癌旁組織、28例正常組織進行檢測，其中癌旁組織男12例，女21例，年齡48～77歲，平均(63.8±9.1)歲。正常組織：其中男10例，女18例，年齡45～75歲，平均(62.9±8.9)歲。三組性別、年齡資料比較均無統計學差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑 CD133多克隆抗體購自英國Abcam公司。ABCG2、p75NTR、EnVisionTM檢測試劑盒購自Gene Tech公司，CD44兔抗人抗體購自武漢博士德公司，羊抗人TROP-2多抗購自美國R&D公司，DAB顯色劑(DAB003)購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2 免疫組織化學染色法 所有組織標本經10%甲醛固定，石蠟包埋組織，連續切片，厚度4 μm，利用二甲苯和乙醇脫蠟水化等處理。切片入pH6.0檸檬酸緩沖液進行沖洗，高溫、高壓抗原修復。自來水沖洗冷卻至室溫后，采用PBS進行液洗3次，5 min/次。用3% H2O2滴加至切片上，室溫孵育30 min，繼而PBS洗滌3次，5 min/次。甩去PBS液，每張切片上滴加50 μl稀釋后的CD133多克隆抗體、ABCG2、p75NTR、CD44兔抗人抗體、羊抗人TROP-2多抗；濕盒內孵育1 h，PBS洗滌3次，5 min/次。甩去PBS液，滴加EnVisionTM試劑盒試劑1，室溫孵20 min，繼而PBS洗滌3次，5 min/次。甩去PBS液，滴加EnVisionTM試劑盒試劑2，室溫孵育30 min，繼而PBS 洗滌3次，5 min/次。甩去PBS液，滴加DAB 顯色液，封片，顯微鏡下觀察，用PBS磷酸緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 陽性結果判斷標準 由2名病理醫生在對標本資料不知情的情況下獨立完成。標準：DAB陽性染色為棕色或黃色，計數4個不重疊的高倍視野下大約200個癌細胞，陽性細胞數>10%為陽性，≤10%為陰性。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件，計量資料組間采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 5種CSC標志物在NSCIC、癌旁組織、正常組織中的表達 CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR在NSCLC組織中的陽性率分別為80.00%、87.50%、50.00%、62.50%、68.75%；在癌旁組織中的陽性率分別為6.06%、30.30%、15.15%、21.21%、12.12%；在正常組織中的陽性率分別為46.43%、10.71%、21.43%、21.43%、21.43%，各指標在不同組織間的陽性率比較均有統計學差異(P<0.05)。

2.2 5種CSC標志物表達與NSCIC病理參數的關系 見表1。隨著細胞分化程度的降低，NSCLC組織中的CD133、CD44、TROP-2、ABCG2及p75NTR的陽性率均呈上升趨勢(P<0.05)；此外，CD133、TROP-2陽性率與NSCIC患者年齡、淋巴結轉移、TNM分期有關(P<0.05)，ABCG2及p75NTR陽性率與NSCIC患者年齡及遠處轉移有關(P<0.05)。

表1 5種CSC標志物表達與NSCIC病理參數的關系〔n(%)〕

臨床病理參數nCD133(n=64)陽性率 P值CD44(n=70)陽性率 P值TROP-2(n=40)陽性率 P值ABCG2(n=50)陽性率 P值p75NTR(n=55)陽性率 P值年齡(歲)<653621(58.33)<0.0527(75.00)>0.0513(36.11)<0.0517(47.22)<0.0519(52.78)<0.05≥654443(97.73)43(97.72)27(61.36)33(75.00)36(81.82)性別男3024(80.00)>0.0529(96.67)>0.0516(53.33)>0.0520(66.67)>0.0520(66.67)>0.05女5040(80.00)41(82.00)24(48.00)30(60.00)35(70.00)吸煙指數<4004534(75.56)>0.0540(88.89)>0.0522(48.89)>0.0530(66.67)>0.0530(66.67)>0.05≥4003530(85.71)30(85.71)18(51.43)20(57.14)25(71.43)遠處轉移有1612(75.00)>0.0515(93.75)>0.058(50.00)>0.0515(93.75)<0.0515(93.75)<0.05無6452(81.25)55(85.94)32(50.00)35(54.69)40(62.50)淋巴結轉移有3028(93.33)<0.0528(93.33)>0.0523(76.67)<0.0520(66.67)>0.0522(73.33)>0.05無5036(72.00)42(84.00)17(34.00)30(60.00)33(66.00)TNM分期Ⅰ3625(69.44)<0.0531(86.11)>0.0510(27.78)<0.0520(55.56)>0.0527(75.00)>0.05Ⅱ1915(78.95)17(89.47)10(52.63)13(68.42)13(68.42)Ⅲ2524(96.00)22(88.00)20(80.00)17(68.00)15(60.00)腫瘤長徑<3cm4534(75.56)>0.0541(91.11)>0.0523(51.11)>0.0529(64.44)>0.0530(66.67)>0.05≥3cm3530(85.71)29(82.86)17(48.57)21(60.00)25(71.43)細胞分化高分化2717(62.96)<0.0521(77.78)<0.059(33.33)<0.0513(48.15)<0.0513(48.15)<0.05中分化4035(87.50)36(90.00)20(50.00)24(60.00)29(72.50)低分化1312(92.31)13(100.00)11(84.62)13(100.00)13(100.00)病理類型鱗癌3529(82.86)>0.0532(91.43)>0.0520(57.14)>0.0522(62.86)>0.0526(74.29)>0.05腺癌2519(76.00)21(84.00)11(44.00)18(72.00)18(72.00)肺泡細胞癌1512(80.00)13(86.67)9(60.00)10(66.67)11(73.33)大細胞未分化54(80.00)4(80.00)000

3 討 論

現代腫瘤手術、放化療、生物治療技術均在不斷進步，但隨著放化療抵抗的發生，NSCLC等腫瘤患者的術后復發率、臨床死亡率仍居高不下〔6，7〕，故尋找NSCLC治療的新靶點，對患者個體化治療及預后具有重要臨床價值。近年研究發現，靶向CSC是根治腫瘤的一個臨床新方向〔8〕，CSC是腫瘤細胞中的特殊細胞，具有極強的自我更新、分化能力，發揮多種功能；此外，CSC具有較強遷徙以及運動能力，可促進細胞轉移，引發腫瘤浸潤和轉移等〔9，10〕，另外，CSC還可長期維持正常機體的相對穩定休眠狀態，有較強的耐藥性。有研究認為〔11〕，CSC是腫瘤發生、發展及復發的源泉，腫瘤生長以及分化最終取決于其組織中CSC表達，同時腫瘤本身具有轉移潛力，當機體CSC表達達到一定程度時，腫瘤的轉移將不可避免。研究人員近年來相繼在膠質瘤、結腸癌、乳腺癌、肝癌等中發現CSC表達〔12〕，而NSCLC組織中的CSC表達及作用機制一直存在較大爭議。研究發現，肺組織中存在細支氣管肺泡干細胞(BASCs)，這為CSC對肺癌的發病作用提供了實驗依據〔13〕。

CD133是Prominin 家族成員，存在于外周血、骨髓、臍帶血及其他組織中〔14〕，CD133+對腫瘤增殖、分化、復發有著關鍵作用〔15，16〕。有研究發現，CD133+表達與腫瘤預后相關，高水平的CD133結直腸癌病人預后較差〔17〕。本研究提示CD133在NSCLC組織中異常高表達，同時腫瘤細胞分化程度越低、TNM分期越高，存在淋巴結轉移患者中的陽性表達率越高，這說明CD133陽性表達參與了NSCLC腫瘤干細胞的增殖、分化及轉移等過程。

CD44是一種廣泛存在于表皮細胞與間皮細胞中的黏附分子，主要參與異質性黏附，即腫瘤細胞與宿主細胞和宿主基質的黏附，異質性黏附在腫瘤細胞侵襲轉移中起促進作用，與惡性腫瘤發生發展密切相關〔18〕。國外文獻報道，CD44在前列腺癌組織中表達升高，與癌細胞生長存在相關性〔19〕。國內有研究〔20〕報道，CD44在NSCLC組織中的陽性率為65.33%，明顯高于正常肺組織的20.00%且CD44過量表達患者的生存率低于正常水平者。本研究與上述研究結果一致，進一步證實CD44的異常表達與NSCLC的發病有關。此外，本研究中CD44陽性表達率隨著腫瘤細胞分化程度的降低而呈上升趨勢，提示CD44陽性表達影響著NSCLC的發生、發展。

TROP-2是一種跨膜糖蛋白，在正常人體合包體滋養層、細胞滋養層及復層上皮細胞均存在表達，具有調節腫瘤細胞生長、侵襲以及轉移的作用。近年來，已證實TROP-2在鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等許多實體瘤中表達水平增高〔21〕。本文結果也說明TROP-2與NSCLC的發生、發展有關。

ABCG2是一種轉運蛋白，在維持細胞自身穩定及機體正常生理功能等方面起著重要作用，主要定位于細胞膜上，正常生理下可保護機體，而對腫瘤而后則可導致其耐藥。研究發現，三磷酸腺苷結合盒轉運體(ABC)僅在干細胞上表達，具有分化調節干細胞作用〔22〕。p75NTR是腫瘤壞死因子受體成員，主要在神經細胞的早期發育過程中大量表達，通過不同的信號轉導通路誘導以神經細胞為主的細胞增殖、遷移、分化、生存、凋亡、突觸的建立和神經的形成,發揮多重生物學效應。早期認為p75NTR僅參與神經細胞發育早期的增殖、遷移、凋亡，近年來研究發現，p75NTR陽性細胞自我更新、增殖及多向分化能力較強，證實為食管上皮CSC〔23〕。本研究結果顯示，ABCG2及p75NTR的表達在腫瘤發生、發展過程中可能發揮作用，但其相關性仍需加大樣本量分析。

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〔2016-07-15修回〕

(編輯 郭 菁)

蔡傳書(1965-)，男，主任醫師，主要從事腫瘤診斷與放射治療方面的研究。

R73

A

1005-9202(2016)23-5905-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.058