生物裂解效應對污泥脫水減量的作用研究

高 磊,張詩文,葉 蓉,康詩佳,余 冉(東南大學能源與環境學院環境科學與工程系,東南大學環境醫學工程教育部重點實驗室,江蘇 南京 210096)

生物裂解效應對污泥脫水減量的作用研究

高 磊,張詩文,葉 蓉,康詩佳,余 冉*(東南大學能源與環境學院環境科學與工程系,東南大學環境醫學工程教育部重點實驗室,江蘇 南京 210096)

從市政污水處理廠活性污泥中篩選培養出噬菌型細菌,并通過噬菌型細菌的富集與投加,探討其對市政污泥生物裂解預處理的有效性及其所受環境影響因素與作用規律.研究結果顯示,市政污泥中存在具有污泥裂解作用的廣譜性噬菌型細菌,宿主菌的投加量可影響噬菌型細菌的富集濃度,但培養基營養物組成濃度對噬菌型細菌的生長增殖無明顯影響.當篩選出的噬菌型細菌以106pfu/mL(污泥)與中性市政污泥在室溫下共存培養24h即可有效裂解污泥細胞,污泥比阻與污泥體積較未投加任何菌劑的參照污泥降低了36%和15%.并可導致胞內營養物的釋放,污泥液相中總氮與總磷濃度較參照污泥分別上升了245%和242%,溶解性COD與總COD比值(SCOD/TCOD)則提高了195%,但生物裂解作用效果并不與裂解時間始終保持正相關性,最佳污泥生物裂解時間為24h.

噬菌型細菌；污泥裂解；宿主菌；污泥比阻

近年來,隨著我國經濟的發展以及城市化進程的加快,城市污水的產生量與處理量逐年增加,從而導致污水處理廠伴生的剩余污泥產量快速增長.污泥的處理處置目前已成為一個世界性的社會和環境問題.截止2015年9月底,全國城鎮累計建成污水處理廠3830座,污水處理能力已達到1.62億m3/d,伴生的污泥已突破3000萬t/年(含水率80%計)[1].

污水處理廠產生的剩余污泥含水量一般達95%以上[2],污泥含水量高且不易脫水.污泥中大量的胞內水與結合水難以通過機械的方式被釋放出來.目前,簡單機械壓濾污泥脫水技術只能將污泥含水率降到 80%左右,造成污泥處理處置費用占到整個污水處理廠總費用的20%～45%[3].現有的物理化學污泥減量預處理技術主要包括超聲波法和化學藥劑調理法等.超聲波法通過超聲波的空穴作用壓碎細胞壁,釋放出細胞內所含的成分和細胞質從而實現污泥減量[4].傳統的化學調理法常使用PAC、FeCl3和PAM等藥劑通過電中和架橋作用促使污泥顆粒絮凝來改善污泥脫水性[5].但是物理方式能耗較高,化學方式中投入的化學藥劑會造成二次污染,影響后續污泥的安全處理處置.因此,迫切需要開發一種科學、高效與環境友好的污泥脫水減量方法.

目前,污泥生物脫水研究主要包括:(1)向污泥中投加酶強化污泥水解,但酶的制備成本高導致其實用性較差;(2)利用微型動物或高等微生物的捕食作用,裂解污泥細胞結構、釋放胞內有機物[6].吳敏等[7]構建了蚯蚓生物反應器,既可滿足污水處理效果、同時大幅減少剩余污泥產量基礎上,使有機物降解率可超過厭氧消化與好氧消化處理.劉宏波等[8]利用蠕蟲進行活性污泥反應器污泥減量,工藝簡單,并改善了污泥沉降性能對環境幾乎無二次污染.但此類方法同時會使化學需氧量(COD)增加,影響出水水質,并且存在動物或高等微生物的數量難以控制,排泄物難以清理等問題.有國外學者指出噬菌體對污泥處置有一定減量效果[9],但噬菌體的安全性難以確保.因此,與噬菌體具有相似生命特征的噬菌型細菌的應用可以避免相關公共健康潛在風險.噬菌型細菌如蛭弧菌類微生物是一類以捕食宿主菌為生的小型寄生性細菌[10],可破壞細胞壁,穿入宿主細胞,裂解大多數科、屬的革蘭氏陰性細菌和部分革蘭氏陽性細菌.到目前為止,各國科學家已分別從土壤、下水道污水、河水、海洋、植物根系、以及人類與哺乳動物糞便中發現了這類微生物.噬菌型細菌在自然界存在的廣泛性、對宿主細胞的裂解高效性與依賴性及對宿主菌的選擇非特異性預示其可以有效破壞細胞壁,影響污泥絮體組成與結構,故在提高污泥脫水減量效率與可生化性上具有巨大應用潛力[11],但目前鮮有相關文獻報道.

本文試利用噬菌型細菌的生長特性進行其在市政污泥裂解減量上的應用可行性研究,通過從市政污泥中篩選培養噬菌型細菌,探討其富集培養影響的因素及在不同環境條件下污泥裂解作用效應,以期為開發出一種兼具生態安全性與反應高效性的污泥破壁脫水減量處理技術提供一條研究新思路.

1 材料與方法

1.1 試驗污泥

本試驗菌種分離純化和污泥減量所用污泥均取自南京某市政污水處理廠二沉池,取樣后立即運往實驗室.在實驗室經過 1d的濃縮沉淀,去掉上清液,將下層污泥混合均勻作為試驗污泥.供試污泥的基本性質如表1所示.

表1 供試污泥基本性質Table 1 Properties of raw sludge

1.2 試劑及儀器

主要培養基:營養肉湯(NB),稀釋營養肉湯培養液(DNB),稀釋營養肉湯(DNB)雙層瓊脂平板培養基,溶菌肉湯(LB)培養基.

主要儀器裝置:高壓滅菌鍋(YXQ-LS-30-SLL),恒溫培養箱(HERATHERM, Thermo),恒溫空氣振蕩器(SHZ-82),污泥比阻測定裝置(HY018),高速冷凍離心機(3-18K, SIGMR),紫外-可見分光度計(752SP).

1.3 試驗方法和分析項目

1.3.1 菌液的制備[12-13]市政污泥經過預處理(振蕩30～40min,靜置30～60min)后取1mL污泥上清液進行10-1～10-7梯度稀釋,并對每一稀釋度于LB固體平板上進行涂布、恒溫培養(30℃).待培養18～24h后,盡可能將平板上孤立的菌落都進行劃線分離.通過三次以上劃線分離純化后,用革蘭氏染色法鑒定出革蘭氏陰性菌,將其作為候選宿主菌.本試驗均選用同一種革蘭氏陰性菌作為宿主菌進行試驗.將宿主菌接種至滅菌 NB液中過夜振蕩培養(30℃,150～200r/min)并離心,所獲菌斑用 0.01mol/L的無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸制成細菌濃度達到(1.0～3.0)×109cfu/mL的宿主菌懸液.

通過DNB雙層瓊脂平板培養基和分離純化出的宿主菌從同一污泥樣品中分離噬菌型細菌,并通過DNB雙層瓊脂平板培養基和滅菌DNB液進行3次以上的純化試驗獲得50個純化的噬菌斑平板.將純化的噬菌斑接種至含有新鮮制備的宿主菌懸液的滅菌 DNB液中震蕩培養(30℃,150～200r/min)后離心濃縮,后通過無菌PBS清洗調整得濃度為107cfu/mL菌液.

1.3.2 高效噬菌菌株的篩選 將50個純化的噬菌型細菌菌斑與宿主菌懸液分別接種至 50mL滅菌DNB液中(30℃,150～200r/min)震蕩培養至溶液變澄清.期間每隔24h測定600nm波長下吸光度,通過吸光度下降率篩選出裂解效果好的細菌以待后續試驗.

1.3.3 噬菌型細菌生長影響因素試驗 利用吸光度(OD600nm)監測宿主細菌裂解速率,分別改變培養環境中培養基營養液濃度和宿主菌投加量,通過測定吸光度的下降速率確定噬菌型細菌增殖情況,得到不同培養條件對噬菌型細菌增殖和噬菌活性的影響.

1.3.4 噬菌型細菌對污泥脫水減量影響的驗證在研究準備階段將污泥和噬菌型細菌共同培養96h,結果顯示污泥在 36h后污泥比阻迅速增大,指示脫水性能顯著變差,故選擇48h作為污泥實驗的時間.將新鮮制備的噬菌型細菌濃縮菌液按照 106pfu/mL(污泥)的細菌濃度加入濃度為(13000±2000)mg/L的試驗污泥中培養48h(30℃, 150r/min),期間每隔 12h測定污泥比阻值和泥餅含水率、以及污泥液相溶解性化學需氧量(SCOD)、總化學需氧量(TCOD)、總磷含量(TP)、總氮含量(TN).

1.3.5 噬菌型細菌裂解污泥環境影響因素探究將新鮮制備的噬菌型細菌濃縮菌液按照 106pfu/mL(污泥)的細菌濃度加入濃度為(13000± 2000)mg/L的試驗污泥中培養 48h (30℃,150r/ min).培養過程中分別探究反應時間和 pH值對噬菌型細菌裂解污泥的影響.

1.3.6 噬菌型細菌的初步鑒定 鑒于 DNB雙層瓊脂平板法是分離純化蛭弧菌類細菌的標準方法[13],故首先嘗試離心分離液體培養的噬菌型細菌菌液(15000r/min,30min),所獲菌斑利用試劑盒PowerWater DNA Isolation Kit(Mobio,美國)提取DNA并進行PCR擴增反應.以增殖培養所用的宿主菌株(Klebsiella)的DNA作為陰性對照.在陽性對照無擴增條帶時,凡在所預定的區域(約800bp)出現擴增條帶的,均可定為陽性.參考文獻[14]設計蛭弧菌類特異性 PCR引物.上游引物(63F):5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’;下游引物(Bdg842R):5’-CGWCACTGAAGGGGTCAA-3’(上海生工生物工程股份有限公司合成).PCR擴增熱循環條件為:94℃熱變性3min;之后94℃1min;56℃退火45s;72℃延伸1min,共35個循環;最后在72℃終延伸10min.將PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測擴增結果.

1.4 測定項目及方法

參照文獻[15-16]通過污泥過濾比阻(SRF)指示污泥脫水性能,并采用污泥比阻測定裝置進行測定.通過布氏漏斗-真空抽濾法對污泥抽濾泥餅含水率進行測定;采用重鉻酸鉀法測定SCOD和TCOD;采用鉬酸銨分光光度法測定TP;采用過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定 TN;采用pH計測定pH值.

2 結果與討論

2.1 高效噬菌菌株的篩選

通過吸光度(OD600nm)測定得到的吸光度下降率從50株分離出的噬菌型細菌中篩選出5株噬菌型細菌(B1-B5),并對該5株細菌再次進行相同宿主菌及菌液濃度條件下的增殖培養對比監測(圖1),以驗證其噬菌性能的穩定性并選擇宿主菌裂解效率最佳的噬菌型細菌.

圖1 不同噬菌型細菌在增殖過程中菌液吸光度的變化Fig.1 Absorption variation profiles of predatory bacteria during their proliferation

圖1結果顯示經過6d培養B1、B2、B3菌株所在菌懸液吸光度下降了 60%～70%,而 B4、B5菌株所在菌懸液吸光度只下降了 50%.此外,在后續的研究中得知污泥最佳脫水效果出現在噬菌型細菌對其進行裂解預處理的24h內.鑒于在前24h內B1、B2、B3菌株所在菌懸液吸光度下降了20%以上,而B4、B5菌株所在菌懸液吸光度只下降了15%.故推測在同一宿主菌條件下,不同噬菌型細菌的增殖和噬菌活性差異較大,并將宿主菌菌液吸光度始終保持快速穩定下降的B1、B2、B3為候選噬菌型細菌.

由圖1中實驗數據計算可知,B3菌株24h內吸光度下降速率為(0.73±0.05)%/h,144h處吸光度下降程度為(67.25±0.44)%,分別為5株噬菌型細菌中最高值.因此為快速富集噬菌型細菌,以提高后續污泥生物裂解效率,現首先選擇富集培養時菌懸液吸光度下降速率與降低程度最高的B3菌株進行后續試驗研究.

2.2 B3菌株的初步鑒定

采用噬菌蛭弧菌 16s rDNA特異性引物63F-842R,以B3菌株的基因組DNA為模板擴增后在大約800bp處有一陽性條帶出現,而增殖培養所用的宿主菌株(Klebsiella)的DNA擴增對照結果為陰性.B3菌株在預定的區域內(約 800bp)均出現擴增條帶,而陰性對照則無條帶出現,由此推測分離得到的B3菌株為蛭弧菌類微生物.

2.3 噬菌型細菌的增殖條件優化

2.3.1 宿主菌投加量對噬菌型細菌增殖的影響 由圖 2可見,雖然菌懸液的吸光度隨培養時間呈下降趨勢,但不同宿主菌投加濃度導致菌懸液的吸光度下降速率與所達最低值有差異,預示噬菌型細菌增殖速率及噬菌活性受初始宿主菌濃度影響.其中在1.38×109cfu/mL宿主菌懸液投加量條件下,吸光度下降程度最大,下降百分比達到(87.02±1.80)%.在24～72h時,吸光度下降較快,且能降到較低的值.與之比較,宿主菌投加濃度較低時,如6.90×108cfu/mL,吸光度無明顯變化,僅下降(27.58±1.53)%;宿主菌投加濃度較高時,如3.45×109cfu/mL,雖然吸光度下降較快,但是不能達到最低值,僅下降(60.54±0.76)%.

圖2 宿主菌投加量對噬菌型細菌增殖的影響Fig.2 Effects of host dosage on predatory bacteria during their proliferation

噬菌型細菌通過化學趨向運動,自由碰撞吸附于宿主細胞上[17].因此宿主菌投加量越高應越利于噬菌型細菌的富集生長,但是從圖2中可以看出宿主菌濃度過高并不能有效促進噬菌型細菌的增殖和自身裂解.這可能是由于噬菌型細菌寄生生長于宿主菌的過程中可代謝產生抑制其裂解活動的副產物,或引起了培養基理化環境的改變[18].

2.3.2 營養液濃度對噬菌型細菌生長的影響 如圖3所示,將1/500 DNB營養液濃度分別擴大2倍,5倍和10倍后發現,營養液濃度對噬菌型細菌生長的影響差異不明顯.噬菌型細菌所在菌懸液的吸光度經過144h富集培養后均下降了60%以上.推測這是由于噬菌型細菌主要利用宿主細胞的肽與氨基酸作為碳源和能源,通過三羧酸循環代謝途徑進行有氧呼吸[19],故在營養液濃度足夠滿足噬菌型細菌生長需要的前提下,當存在相關濃度的宿主菌時,再提高培養基營養液濃度,無法有效提高噬菌型細菌的富集濃度.

圖3 營養液濃度對噬菌型細菌增殖的影響Fig.3 Effects of nutrient concentration on predatory bacteria during their proliferation

2.4 噬菌型細菌對污泥脫水減量性能影響

將 5株相同數量級濃度的不同噬菌型細菌(B1-B5)分別投加到污泥中混合培養以驗證其對污泥絮體的裂解脫水減量效應,結果顯示(圖4),經12h混合培養后,投加有噬菌型細菌的污泥比阻值明顯低于參照污泥k,含B1、B2和B3菌株的污泥在裂解作用24h后的污泥比阻值發生了顯著降低,隨后開始回升,其規律與原始污泥一致,但比阻值遠低于原始污泥.其中含B3菌株的污泥在裂解作用 24h后的污泥比阻值比參照污泥 k低(18.88±0.72)%,比初始比阻值降低(16.41±0.74)%,顯示經生物裂解的污泥脫水性能得到提高.

如圖5所示,將5株相同數量級濃度的不同噬菌型細菌(B1-B5)分別與污泥混合培養不同時間后的污泥經真空抽濾(0.045MPa,10min)測定泥餅含水率發現,經 12h生物裂解后,投加有B1-B4菌株的污泥泥餅含水率已明顯低于參照污泥k,含B3菌株的污泥在裂解作用24h后的泥餅含水率為(75.64±0.16)%,與參照污泥k相比降低了(4.52±0.21)%,即經B3裂解壓濾后的污泥體積比參照污泥k可減少(14.72±0.67)%.不同噬菌型細菌的污泥裂解作用效率差異較大,通過對比生物裂解作用下污泥比阻值和濾餅含水率的降低速率,結合增殖培養過程中吸光度下降速率,發現 B3菌株裂解性能最高效且穩定,因此篩選出B3菌株以進行后續研究.

圖4 污泥裂解時不同種類噬菌型細菌對污泥比阻的影響Fig.4 Effects of predatory bacteria species on specific resistance to filtration (SRF) of sludge during sludge digestion

圖5 不同種類噬菌型細菌對泥餅含水率的影響Fig.5 Effects of predatory bacteria species on sludge on sludge cake moisture content

2.5 噬菌型細菌對污泥破解效果的影響研究

投加B3菌株106pfu/mL(污泥)于新鮮采集的市政污泥中,如圖 6所示,污泥的比阻值都在109～1010s2/g范圍內,屬于可脫水污泥,且投加 B3菌株的污泥比阻在反應 12h后明顯低于參照污泥k.同時,隨著作用時間達24h時,污泥比阻進一步降低到最低(1.53±0.01)×109s2/g,為初始值的(64.00±0.51)%,降低(36.00±0.51)%.隨后開始隨作用時間增加而緩慢回升,而參照污泥k的污泥比阻在作用時間達12h降至最低點后,立即開始回升,兩種污泥的比阻變化差異明顯.污泥生物裂解過程中比阻的這種變化趨勢與 Liu等人[20]通過生物浸出方法所獲研究結果相似,即污泥脫水性能隨處理時間延長首先得到提高,但隨后即開始下降,經處理的污泥甚至比原始污泥脫水性能更差.因此,噬菌型細菌短期內即可顯著提高污泥脫水性能,但其作用效果并不和生物裂解時間成正相關性.

圖6 投加B3菌株后污泥比阻隨時間的變化Fig.6 Specific resistance to filtration (SRF) of sludge variation profiles during the sludge digestion with B3 strain

一般來說,SCOD濃度越高,污泥中的易生物降解性碳源越豐富,污泥中有機物的大量溶出是改善污泥后續處理的必要條件[19].從圖7可以看出,投加 B3菌株的污泥樣品比參照污泥 k的SCOD濃度在 12h、24h、36h處分別提高了(133.00±9.61)% 、 (189.26±6.66)% 、 (227.59± 3.25)%. SCOD/TCOD比值是指示污泥裂解程度的重要指標,同時在很大程度上能夠反映水中難溶性有機物的轉化.投加 B3菌株的污泥樣品SCOD/TCOD比值隨裂解時間的增加迅速提高,而參照污泥k的SCOD/TCOD比值卻沒有顯著變化.在24h內污泥樣品SCOD/TCOD比值提高為初始值的 4.5倍,比參考污泥 k提高(194.73± 4.11)%.這可能是由于在噬菌型細菌的作用下污泥細胞裂解,污泥結構被破壞,固相有機物如蛋白質、糖類和脂肪等逐漸釋放,由固相轉移到液相,使SCOD濃度升高[21].因此,污泥的生物裂解預處理不僅可幫助提高污泥脫水性能,還可提高污泥在微生物厭氧發酵中的可生化性,為后續的污泥進一步處理處置創造有利的條件.

圖7 投加B3菌株后污泥SCOD及SCOD/TCOD隨時間的變化Fig.7 SCOD and SCOD/TCOD variation profiles during the sludge digestion with B3 strain

2.6 pH值對噬菌型細菌裂解污泥過程影響

已知噬菌型細菌的鞭毛運動對 pH變化反應敏感[22],從而可影響其對宿主菌的侵染能力進而影響其對污泥的生物裂解效率.鑒于污泥經24h生物裂解處理后,污泥比阻即可顯著降低,故本次試驗進行初始pH值不同的污泥生物裂解24h處的影響研究.如圖8所示,在污泥生物裂解反應24h后,污泥初始pH值為7.0的污泥比阻降低最明顯.本次試驗同時測定了污泥液相中TN、TP濃度的變化,發現其在 pH=7.0條件下的值也分別增加(245.26± 0.54)%和(242.83±0.35)%,該結果再次證實B3菌株的有效污泥裂解作用以及生物裂解后細胞胞內物質向液相的釋放過程[23].故污泥在中性條件下即可獲得最佳的生物裂解脫水減量效率.

圖8 污泥pH值對投加經B3菌株24h裂解后污泥液相TN、TP濃度與污泥比阻的影響Fig.8 Effects of pH on soluble TN, TP concentrations and specific resistance to filtration (SRF) of sludge after 24h sludge digestion with B3 strain

3 結論

3.1 市政污水處理廠活性污泥中廣泛存在噬菌型細菌及大量革蘭氏陰性菌,使得從污泥環境中分離與富集出高效裂解活性的噬菌型細菌并且將其應用到污泥減量上成為可能.

3.2 噬菌型細菌的富集生長受宿主菌投加量影響,并且不同噬菌型細菌的生長速率差異明顯.在培養基營養充分條件下,提高營養液濃度對噬菌型細菌的富集生長影響不大.

3.3 噬菌型細菌對市政污泥生物的裂解可有效降低其污泥比阻,并可釋放細胞胞內營養物質,提高SCOD/TCOD值.但隨裂解時間的延長,污泥比阻會回升,故噬菌型細菌在提高污泥脫水減量效率和在微生物厭氧發酵中的可生化性上具有一定應用前景.

3.4 鑒于噬菌型細菌在 24h內市政污泥生物的裂解效果明顯,且中性污泥(pH=7.0)有利于生物裂解處理.故得到最佳裂解條件為24h及中性環境.

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Effects of biolysis pretreatment on sludge dewatering and reduction.

GAO Lei, ZHANG Shi-wen, YE Rong, KANG Shi-jia, YU Ran*(Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, Department of Environmental Science and Engineering, School of Energy and Environment, Southeast University, Southeast University, Nanjing 210096, China). China Environmental Science, 2016,36(12)：3717～3723

The predatory bacteria with high cell lysis capacity was isolated and screened from the activated sludge of a municipal wastewater treatment plant. The efficiency of sludge biolysis with an addition of the enriched predatory bacteria for enhancing its dewaterability was evaluated and the associated environmental impact factors were investigated. The results indicated that the predatory bacteria with a broad range of hosts were abundant in the municipal sewage sludge and greatly benefited sludge lysis. The concentration of the predatory bacteria enrichment could be improved with the increase of host dosage but not the concentration of the culture medium. When the neutral municipal sludge was incubated with the screened predatory microbes at the concentration of 106pfu/mL for 24h at room temperature, the values of the specific resistance to filtration (SRF) and the volume of the treated sludge were 36% and 15% lower than the control sludge without bacteria addition, respectively. Meanwhile, the cell lysis led to the release of intracellular nutrients. The concentrations of total nitrogen (TN) and total phosphorous (TP) in the liquid phase of the treated sludge were increased by 245% and 242%, respectively and the ratio of SCOD/TCOD was increased by 195%. However, there is no positive correlation between the biolysis effect and the reaction time and the optimal sludge biolysis reaction time was 24h.

predatory bacteria；sludge lysis；host bacteria；specific resistance to filtration of sludge

X705

A

1000-6923(2016)12-3717-07

高 磊(1996-),男,陜西寶雞人,東南大學能源與環境學院博士研究生,主要研究方向為環境生物技術在水處理和環境修復中的運用.

2016-05-28

國家自然科學基金資助項目(51208092);江蘇省人力資源和社會保障局留學人員科技活動項目擇優資助項目(2014)

* 責任作者, 副教授, yuran@seu.edu.cn