東海海域表層沉積物中硫酸鹽還原菌分布特征研究

張 玉,賀 惠,米鐵柱,甄 毓*,付璐璐,陳 燁(1.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266100；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266100；3.海洋國家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071；4.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)

東海海域表層沉積物中硫酸鹽還原菌分布特征研究

張 玉1,2,3,賀 惠2,3,4,米鐵柱1,2,3,甄 毓1,2,3*,付璐璐2,3,4,陳 燁2,3,4(1.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266100；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266100；3.海洋國家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071；4.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003)

利用2011年4、7、8和10月對(duì)東海海域4個(gè)航次的調(diào)查資料,以表層沉積物中硫酸鹽還原菌(SRB)為研究對(duì)象,針對(duì)于SRB所共有的異化型亞硫酸鹽還原酶(DSR)中的β亞基基因(dsrB),通過熒光定量PCR技術(shù)對(duì)SRB豐度的時(shí)空分布特征進(jìn)行了描述.結(jié)果表明,SRB豐度變化范圍為1.87×105～4.69×108cells/g,平均值為1.15×108cells/g,且4月SRB豐度最低,7月SRB豐度最高;SRB數(shù)量在總細(xì)菌中的比例介于0.0039%～1.6176%之間,說明SRB在東海表層沉積物的細(xì)菌總量中比例很小;SRB豐度的水平分布特征整體表現(xiàn)為南部海域高于北部海域,長江口及浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)高于非泥質(zhì)區(qū).此外,SRB豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性分析表明,溫度和溶解氧是影響SRB豐度的重要因素.

東海；硫酸鹽還原菌；豐度；沉積物

硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)是一類以有機(jī)化合物或無機(jī)化合物為電子供體,還原硫酸鹽產(chǎn)生硫化物的原核微生物類群

[1].在土壤、油田、植物根際、有機(jī)廢水、重金屬污染區(qū)域、腐敗的食物、動(dòng)物腸道、海洋和淡水沉積物、深海熱液口等多種環(huán)境中均有SRB的存在,其中富含有機(jī)質(zhì)和硫酸鹽的低氧或厭氧海洋沉積物是其典型生境[2-3].研究者發(fā)現(xiàn)海洋沉積物中50%以上的有機(jī)碳礦化是通過SRB來完成的[4].因此,SRB在生源要素生物地球化學(xué)循環(huán)中起著重要作用.

作為硫元素的最高氧化形式,硫酸鹽是一種化學(xué)惰性分子,只有在生物催化作用下通過同化型還原或異化型還原兩種方式將其還原.其中SRB是異化型硫酸鹽還原過程中的重要執(zhí)行者,其過程為在ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸還原酶(adenosine-5′-phosphosulfate reductase, APS)的作用下獲得2個(gè)電子成為,-在亞硫酸鹽還原酶復(fù)合酶系的催化下,通過一系列電子轉(zhuǎn)移最終還原形成硫化物.在由生成硫化物這一關(guān)鍵步驟中,異化型亞硫酸鹽還原酶(dissimilatory sulfite reductase, DSR)是起關(guān)鍵作用的催化酶,它由兩個(gè)不同的多肽亞基 a2?2結(jié)構(gòu)組成,在有些SRB中它是以三個(gè)亞基a2?2γ2結(jié)構(gòu)的聚合體形式存在[5].以編碼一些關(guān)鍵酶的基因?yàn)榛A(chǔ),利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)環(huán)境中微生物群落特征和生態(tài)功能的研究已成為微生物分子生態(tài)學(xué)研究的一種有效方法[6-9].目前已有大量研究對(duì) dsr基因序列進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)在所有已知SRB物種中均有dsr基因存在,并具有部分高度保守區(qū)域[10-11].以此為基礎(chǔ),研究者已經(jīng)成功利用功能基因dsrAB或其兩個(gè)亞基dsrA、dsrB研究了SRB在各種自然環(huán)境中的種類、豐度、活性及分布[12-18].

東海作為世界上最廣闊的陸架邊緣海之一,受到黑潮、臺(tái)灣暖流、長江沖淡水等多種環(huán)流系統(tǒng)的相互作用,獨(dú)特的地理位置和地形結(jié)構(gòu),共同形成了東海海域復(fù)雜的水文環(huán)境及沉積動(dòng)力環(huán)境[19].因此,東海海域中微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性受到了廣泛關(guān)注.其中,已有關(guān)于東海海域中SRB群落結(jié)構(gòu)、多樣性和豐度的報(bào)道[20-24],但關(guān)于東海海域中SRB豐度的時(shí)空分布特征的報(bào)道相對(duì)較少.本文根據(jù)2011年東海4個(gè)航次的調(diào)查資料,分析討論了調(diào)查海域表層沉積物中SRB豐度的分布特征,旨在較系統(tǒng)地獲取和認(rèn)識(shí)東海海域中SRB的豐度信息,加深對(duì)SRB在環(huán)境中生態(tài)功能的認(rèn)識(shí),為研究東海海域碳、硫等生源要素的循環(huán)提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用的表層(0～1cm)沉積物樣品于2011年4月、7月、8月和10月用箱式采泥器在我國東海海域采集(圖 1).樣品采集后,分裝于無菌密封袋中,并保存在-80°C用于DNA提取.

圖1 2011年東海海域采樣站位示意Fig.1 Sampling station in the East China Sea during 2011

1.2 理化參數(shù)測(cè)定

利用 RBR XR-620多參數(shù) CTD(Elcee, Malaysia)對(duì)各站位水深及底層水的溫度、鹽度、溶解氧進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定.

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

取約 50g沉積物樣品自然解凍且徹底混勻后,將其中1g樣品(濕重)置于10mL無菌聚乙烯管中,利用DNA抽提試劑盒QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)提取總DNA,所有操作均參照試劑盒說明書.將提取的DNA作為PCR擴(kuò)增的模板,分別使用細(xì)菌 16SrRNA基因引物(341F:CCT ACG GGA GGC AGC AG和518R:ATT ACC GCG GCT GCT GG)[26]和硫酸鹽還原菌 dsrB引物(DSR-p2060F:5’-CAA CAT CGT YCA YAC CCA GGG 和 DSR-4R: 5’-GTG TAG CAG TTA CCG CA)[27]進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94℃,10min;94℃,30s,53℃(16S rRNA基因)或55℃(dsrB基因),40s,72℃,1min,35個(gè)循環(huán);72℃,10min.反應(yīng)結(jié)束后用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果,并用 DNA膠回收試劑盒(寶生物,大連)純化目標(biāo)產(chǎn)物,然后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng),通過藍(lán)白斑方法篩選得到轉(zhuǎn)入目的基因的陽性克隆,并將其轉(zhuǎn)入 Luria-Bertan液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng).以培養(yǎng)后的菌液為模板,使用通用引物M13F(-47)和M13R(-48)進(jìn)行菌落PCR.反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)插入片段大小,取部分含有正確插入片段的菌液送去測(cè)序(華大基因,北京).將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為陽性克隆的菌液用快速質(zhì)粒小提試劑盒(康為世紀(jì),北京)提取質(zhì)粒.通過 Picodrop核酸和蛋白質(zhì)分析儀(Picodrop,英國)測(cè)定質(zhì)粒濃度,并將其按10倍梯度進(jìn)行稀釋,分別得到16S rRNA基因和dsrB基因熒光定量 PCR(qPCR)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,放入-80℃冰箱保存待用.

1.4 16S rRNA基因和dsrB基因熒光實(shí)時(shí)定量PCR

采用FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)試劑盒(羅氏,德國),分別以 341F/518R和DSR-p2060F/DSR-4R為引物,梯度稀釋的 16S rRNA基因和 dsrB基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,在ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國)上進(jìn)行 qPCR分析.20μL的反應(yīng)體系包括:10μL ROX,0.3μmol/L正反向引物,0.2μg/μL牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA),2μL DNA模板.反應(yīng)的條件為:50℃,2min,94℃,10min;94℃, 15s,60℃(16S rRNA 基因)或 55℃(dsrB基因),40s,72℃,45s,35個(gè)循環(huán).在所有樣品的實(shí)驗(yàn)中,每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn),每組反應(yīng)添加陰性對(duì)照.反應(yīng)結(jié)束后通過溶解曲線分析和 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果,并使用 ABI PRISM 7500軟件(version 1.3.1)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,構(gòu)建16S rRNA基因和dsrB基因標(biāo)準(zhǔn)曲線.按照上述qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,以環(huán)境樣品 DNA為模板對(duì)16S rRNA基因dsrB基因進(jìn)行qPCR分析,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算環(huán)境樣品中16S rRNA基因和dsrB基因拷貝數(shù),同時(shí)以每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中平均含有3.6個(gè)16S rRNA基因拷貝[28]和每個(gè)SRB細(xì)胞中平均含有1個(gè)dsrB基因拷貝[29]為基礎(chǔ),分別將16S rRNA基因和dsrB基因的拷貝數(shù)換算成細(xì)胞數(shù)目,并在此基礎(chǔ)上計(jì)算SRB豐度在總細(xì)菌中所占比例.

1.5 數(shù)據(jù)分析分別

數(shù)據(jù)分析使用軟件SPSS19.0.利用非參數(shù)檢驗(yàn)分析比較調(diào)查海域采樣站位的理化參數(shù),采用單因素方差分析(One way ANOVA)對(duì)總細(xì)菌數(shù)量及SRB數(shù)量的分布進(jìn)行分析,SRB豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性分析采用皮爾森(Pearson)相關(guān)系數(shù)法.

2 結(jié)果

2.1 理化參數(shù)

2011年4月、7月和8月東海海域不同采樣站位之間的水深變化較大(13～79m),平均水深為44m.對(duì)采樣站位底層水的溫度、鹽度及溶解氧的非參數(shù)檢驗(yàn)分析表明,溫度(11.38～27.24℃)和溶解氧濃度(1.11～12.96mg/L)在不同月份之間具有明顯變化(P＜0.05),且4月溫度明顯小于7月和8月,7月溶解氧明顯小于4月和8月.此外,鹽度在不同月份之間無明顯變化(P＞0.05),其平均值為32.00.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

16S rRNA基因和dsrB基因qPCR分析的溶解曲線均為單一峰,表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無引物二聚體和非特異擴(kuò)增的影響,且Ct值與質(zhì)粒拷貝數(shù)以10為底的對(duì)數(shù)值具有很好的線性反比關(guān)系(R2＞0.99).

2.3 東海海域表層沉積物中總細(xì)菌的分布狀況

對(duì)采樣站位表層沉積物中16S rRNA基因定量分析表明(表1和圖2),在所有樣品中每克沉積物中的總細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量介于 9.31×108～6.34×1010之間,平均值為 1.78×1010cells/g.這一結(jié)果與 Liu等[24]對(duì)渤海、黃海、東海海域表層沉積物中細(xì)菌豐度的研究結(jié)果相似.利用SPSS 19.0軟件對(duì)2011年4月、7月、8月和10月調(diào)查海域中總細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行了ANOVA分析,結(jié)果表明4個(gè)月份中總細(xì)菌數(shù)量無明顯差別(P＞0.05).此外,總細(xì)菌數(shù)量整體分布表現(xiàn)為南部海域大于北部海域,近海海域大于遠(yuǎn)海海域.

表1 2011年東海海域表層沉積物中總細(xì)菌豐度、SRB豐度及SRB豐度在總細(xì)菌中所占比例Table 1 Total bacteria abundance, SRB abundance and the proportion of SRB to the total bacteria abundance in the East China Sea during 2011

圖2 2011年4月、7月、8月和10月東海海域表層沉積物中總細(xì)菌豐度(cells/g)的水平分布Fig.2 Horizontal distribution of total bacterial abundance (cells/g) in surface sediments from the East China Sea during 2011

2.4 東海海域表層沉積物中SRB豐度的分布狀況

2.4.1 東海海域表層沉積物中SRB豐度的總體分布 對(duì)采樣站位表層沉積物中dsrB基因定量分析結(jié)果如表1和圖3所示,在所有站位中均檢測(cè)到dsrB基因,說明SRB廣泛分布于東海海域表層沉積物中.SRB豐度變化范圍為 1.87×105～4.69×108cells/g,平均值為1.15×108cells/g.對(duì)SRB豐度在總細(xì)菌數(shù)中所占比例的分析發(fā)現(xiàn)(表1和圖 4),SRB豐度與總細(xì)菌數(shù)的比例在 0.0039%～1.6176%之間,平均值為 0.4805%,由此可見,SRB在東海表層沉積物的細(xì)菌總量中比例很小.

2.4.2 東海海域表層沉積物中SRB豐度的時(shí)間變化 東海海域表層沉積物中SRB豐度隨時(shí)間的變化如圖5(a)所示,4月SRB豐度相對(duì)較低,7月SRB豐度相對(duì)較高,且每個(gè)月份不同站位之間SRB的豐度具有一定的波動(dòng)性.利用 SPSS 19.0軟件對(duì)4個(gè)月份中SRB豐度進(jìn)行了ANOVA分析,結(jié)果表明,4月與7月、8月及10月之間SRB豐度均具有明顯差異(P＜0.05),7月、8月和10月之間SRB豐度無明顯差異(P＞0.05).此外,SRB豐度在總細(xì)菌中的比例整體表現(xiàn)為 4月最低,7月最高(圖5(b)),且其隨時(shí)間的變化趨勢(shì)與SRB豐度隨時(shí)間的變化相一致.

2.4.3 東海海域表層沉積物中SRB豐度的水平分布 如圖3所示,調(diào)查海域中4個(gè)月份SRB豐度的水平分布特征大體相同,均為南部海域大于北部海域,長江口及浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)大于非泥質(zhì)區(qū)(圖6).

圖3 2011年4月、7月、8月和10月東海海域表層沉積物中SRB豐度(cells/g)的水平分布Fig.3 Horizontal distribution of SRB abundance (cells/g) in surface sediments from the East China Sea during 2011

圖4 2011年4月、7月、8月和10月東海海域表層沉積物中SRB豐度在總細(xì)菌中所占比例的水平分布Fig.4 Horizontal distribution of the proportion of SRB to the sedimentary total bacteria abundance in the East China Sea during 2011

圖5 東海海域表層沉積物中SRB豐度(a)及SRB豐度在總細(xì)菌中比例(b)隨時(shí)間的變化Fig.5 The temporal distribution of SRB abundance (a) and the proportion of SRB to the sedimentary total bacteria abundance (b) in the East China sea during 2011

圖6 2011年4月、7月、8月和10月東海海域泥質(zhì)區(qū)與非泥質(zhì)區(qū)SRB豐度Fig.6 The abundance of SRB in mud and non-mud area from East China sea during 2011

2.5 SRB豐度與環(huán)境因子的關(guān)系

如圖7所示,表層沉積物中SRB的豐度與底層水環(huán)境因子之間的關(guān)系整體表現(xiàn)為,SRB的豐度隨溫度的升高而增大,隨溶解氧的增大而降低,與鹽度之間未呈現(xiàn)明顯的關(guān)系.利用 SPSS軟件進(jìn)一步對(duì)SRB的豐度與環(huán)境因子之間的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):SRB的豐度與溫度呈正相關(guān)(r=0.52, P＜0.05),與溶解氧含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.61,P＜0.05),與鹽度之間的沒有明顯的相關(guān)性(r=0.27, P＞0.05).

3 討論

SRB多樣化的生理生化特征使其幾乎在所有的生態(tài)系統(tǒng)中均能檢測(cè)到,且其功能和數(shù)量在多種生態(tài)系統(tǒng)中都起到了重要作用.從環(huán)境中獲取SRB的數(shù)量信息,對(duì)深入研究SRB的生態(tài)功能具有重要的意義.

圖7 SRB的豐度與環(huán)境因子之間的關(guān)系Fig.7 Relationship between abundance of SRB and environmental parameters

通過對(duì)dsrB基因的熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),東海海域表層沉積物中 SRB豐度在 1.87×105～4.69×108cells/g之間.這一結(jié)果與 Liu等[24]對(duì)渤海、黃海、東海海域表層沉積物中SRB豐度的檢測(cè)結(jié)果基本一致;同時(shí),這一結(jié)果也與世界其它多個(gè)海域表層沉積物中SRB豐度的檢測(cè)結(jié)果相似[30-33].此外,對(duì) SRB豐度在總細(xì)菌數(shù)中所占比例的分析發(fā)現(xiàn),SRB在東海表層沉積物的細(xì)菌總量中比例很小(0.0039%～1.6176%).與此類似,Liu等[24]利用 dsrB基因?qū)χ袊辈窟吘壓１韺?0～2cm)沉積物中SRB的研究發(fā)現(xiàn),SRB豐度與總細(xì)菌數(shù)的比例小于1%;Jiang等[34]利用dsrB基因?qū)χ榻诔练e物中SRB的垂直分布和多樣性的研究表明,表層(0～2cm)沉積物中 SRB豐度與總細(xì)菌數(shù)的比例約為2%.此外,這與利用dsrA和APS的α亞基基因(aprA)對(duì)SRB豐度的研究結(jié)果類似[14,31-32].值得注意的是,2012年Quillet等[35]對(duì)英國梅德韋河鹽沼區(qū)內(nèi)SRB豐度進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),表層(0～2cm)沉積物中 SRB豐度與總細(xì)菌數(shù)的比例約為22%.另外,利用斑點(diǎn)雜交法和熒光原位雜交技術(shù)對(duì)SRB的研究中發(fā)現(xiàn)表層沉積物中SRB豐度在總細(xì)菌中所占的比例在2～25%之間[36-40].這些研究結(jié)果表明,在不同海域表層沉積物中SRB分布廣泛且其豐度在總細(xì)菌數(shù)中的比例具有一定差異,這可能與不同海域的環(huán)境特征相關(guān).如在受到重金屬污染的梅德韋河鹽沼區(qū),由于重金屬對(duì)絕大多數(shù)微生物具有毒性使得該區(qū)域內(nèi)的總細(xì)菌豐度下降,而SRB對(duì)重金屬具有與一定的耐受性使其在該區(qū)域內(nèi)保持較高豐度,因此SRB的豐度在總細(xì)菌豐度中的比例相對(duì)其它海域較高[35].

對(duì)不同月份之間 SRB豐度的比較分析發(fā)現(xiàn),4個(gè)月份中SRB豐度4月相對(duì)較低,7月相對(duì)較高,這可能是由于7月相對(duì)于4月的底層水相對(duì)較高的溫度及相對(duì)的低氧環(huán)境,為SRB提供了更適宜的生長環(huán)境.與此類似,象山港海域 SRB豐度的季節(jié)變化的研究表明,7月SRB豐度明顯的高于1月、4月和11月[41];Leloup等[42]對(duì)法國塞納河口區(qū)SRB的研究中也發(fā)現(xiàn)SRB的豐度具有季節(jié)性變化,7月SRB的豐度高于3月、9月和11月.另外,也有報(bào)道稱SRB豐度無季節(jié)性變化[43-44],這可能是由于不同研究區(qū)域的理化環(huán)境在不同季節(jié)的變化程度不同所致.

對(duì)SRB豐度的水平分布研究表明,長江口及浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)大于非泥質(zhì)區(qū).長江口泥質(zhì)區(qū)和浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)是東海內(nèi)陸架的 2個(gè)主要泥質(zhì)沉積區(qū),長江入海攜帶的大量有機(jī)物質(zhì)主要沉積在這2個(gè)區(qū)域[45-46].由此推測(cè),長江口及浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)中豐富的有機(jī)質(zhì)為SRB生長提供了充足的營養(yǎng)和良好的環(huán)境.目前已有報(bào)道指出有機(jī)物可能是影響 SRB豐度的重要因素,如:Kawahara等[44]對(duì)漁場(chǎng)中SRB分布的研究發(fā)現(xiàn)沉積物中有機(jī)物的含量越高SRB豐度越高;同時(shí)在營養(yǎng)豐富的漁場(chǎng)沉積物中克隆測(cè)序得到的大部分序列屬于SRB,推測(cè)SRB的豐度隨有機(jī)物含量的增加而增大[47-48];Blazejak等[32]對(duì)秘魯邊緣海及黑海表層沉積物中SRB的研究中也發(fā)現(xiàn)了有機(jī)物含量是影響SRB豐度的重要因素.另外, Kondo等[33]對(duì)漁場(chǎng)中SRB豐度的研究發(fā)現(xiàn),SRB的豐度與顆粒有機(jī)碳具有顯著正相關(guān)性(r=0.44, P=0.0019); 2015年He等[23]對(duì)東海海域表層沉積物中SRB的研究中也發(fā)現(xiàn)SRB的豐度與沉積物中總有機(jī)碳的含量具有顯著的正相關(guān)性(r=0.453, P＜0.05).由此推測(cè),沉積物中的有機(jī)物含量對(duì)SRB的豐度分布起著重要作用.此外,SRB的豐度與環(huán)境因子之間的相關(guān)性分析表明,溫度和溶解氧與SRB的豐度具有顯著相關(guān)性,鹽度與SRB豐度之間未呈現(xiàn)顯著相關(guān)性.溫度是影響SRB代謝活動(dòng)和生長繁殖的重要因素,Leloup等[42]對(duì)法國塞納河口區(qū)SRB的研究中發(fā)現(xiàn)溫度的升高和dsrAB基因拷貝數(shù)的增加具有同步性.高愛國等[49]對(duì)北極沉積物中SRB的研究也發(fā)現(xiàn)SRB的豐度與底層水溫之間有良好正相關(guān)性. SRB屬于兼性厭氧菌,對(duì)氧氣具有一定的耐受性,但當(dāng)氧氣及氧化態(tài)化合物的含量過高時(shí),會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中氧化還原電位過高從而抑制SRB生長[50]. SRB廣泛存在于不同的鹽度梯度的環(huán)境中[51-54],其適宜生長的鹽度與其存在的環(huán)境具有很大的關(guān)系,本研究中鹽度環(huán)境相對(duì)較穩(wěn)定,對(duì) SRB豐度的影響較小.綜上所述,本研究區(qū)域中影響SRB豐度的主要環(huán)境因素有溫度和溶解氧.

本研究對(duì)SRB的豐度與環(huán)境因子之間的關(guān)系進(jìn)行了初步探討,但沉積物中硫化物、硫酸鹽、有機(jī)質(zhì)含量等因素也會(huì)對(duì)SRB分布帶來重要影響,后續(xù)研究需要加強(qiáng)對(duì)這些因素的測(cè)定與分析,才能更全面理解東海海域沉積物中硫酸鹽還原菌的群落結(jié)構(gòu)與特征,為研究東海海域碳、硫等生源要素循環(huán)提供可靠依據(jù).

4 結(jié)論

4.1 SRB廣泛分布于東海海域表層沉積物中,且其豐度在東海表層沉積物的細(xì)菌總量中比例較小.

4.2 4月SRB豐度明顯低于7、8和10月,且其峰值出現(xiàn)在7月;SRB豐度的水平分布特征整體表現(xiàn)為南部海域高于北部海域,東海內(nèi)陸架長江口泥質(zhì)區(qū)及浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)高于非泥質(zhì)區(qū).

4.3 SRB豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性分析表明,東海海域采樣站位底層水的溫度和溶氧是影響表層沉積物中SRB豐度的重要因素.

[1] 任南琪,王愛杰,趙陽國.廢水厭氧處理硫酸鹽還原菌生態(tài)學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2009:1.

[2] Pester M, Knorr K H, Friedrich M W, et al. Sulfate-reducing microorganisms in wetlands—fameless actors in carbon cycling and climate change [J]. Frontiers in Microbiology, 2012,3(72):1-19.

[3] Rabus R, Venceslau S S, W?hlbrand L, et al. Chapter Two-A post-genomic view of the ecophysiology, catabolism and biotechnological relevance of sulphate-reducing prokaryotes [J]. Advances in Microbial Physiology, 2015,66:55-321.

[4] J?rgensen B B. Mineralization of organic matter in the sea bed-the role of sulphate reduction [J]. Nature, 1982,296:643-645.

[5] Molitor M, Dahl C, Molitor I, et al. A dissimilatory sirohaemsulfite-reductase-type protein from the hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum islandicum [J]. Microbiology, 1998,144(2): 529-541.

[6] 鮑林林,王曉燕,陳永娟,等.北運(yùn)河沉積物中主要脫氮功能微生物的群落特征 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2016,36(5):1520-1529.

[7] 洪 晨,邢 奕,司艷曉,等.鐵礦區(qū)內(nèi)重金屬對(duì)土壤氨氧化微生物群落組成的影響 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(5):1212-1221.

[8] 鮑林林,陳永娟,王曉燕.北運(yùn)河沉積物中氨氧化微生物的群落特征 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2015,35(1):179-189.

[9] Dechesne A, Musovic S, Palomo A, et al. Underestimation of ammonia-oxidizing bacteria abundance by amplification bias in amoA-targeted qPCR [J]. Microbial biotechnology, 2016,9:519-524.

[10] Wagner M, Roger A J, Flax J L, et al. Phylogeny of dissimilatory sulfite reductases supports an early origin of sulfate respiration [J]. Journal of Bacteriology, 1998,180(11):2975—2982.

[11] Joulian C, Ramsing N B, Ingvorsen K. Congruent phylogenies of most common small-subunit rRNA and dissimilatory sulfite reductase gene sequences retrieved from estuarine sediments [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001,67(7):3314-3318.

[12] Frank K L, Rogers D R, Olins H C, et al. Characterizing the distribution and rates of microbial sulfate reduction at Middle Valley hydrothermal vents [J]. The ISME Journal, 2013,7(7): 1391-1401.

[13] Robador A, Jungbluth S P, Larowe D E, et al. Activity and phylogenetic diversity of sulfate-reducing microorganisms in low-temperature subsurface fluids within the upper oceanic crust [J]. Frontiers in Microbiology, 2015,5(748):748-761.

[14] Leloup J, Loy A, Knab N J, et al. Diversity and abundance of sulfate-reducing microorganisms in the sulfate and methane zones of a marine sediment, Black Sea [J]. Environmental Microbiology, 2007,9(1):131-142.

[15] Leloup J, Fossing H, Kohls K, et al. Sulfate-reducing bacteria in marine sediment (Aarhus Bay, Denmark): abundance and diversity related to geochemical zonation [J]. Environmental Microbiology, 2009,11(5):1278-1291.

[16] Colin Y, Go?i-Urriza M, Caumette P, et al. Combination of high throughput cultivation and dsrA sequencing for assessment of sulfate-reducing bacteria diversity in sediments [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2013,83(1):26-37.

[17] Liu Y R, Zheng Y M, Zhang L M, et al. Linkage between community diversity of sulfate-reducing microorganisms and methylmercury concentration in paddy soil [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2014,21(2):1339-1348.

[18] Müller A L, Kjeldsen K. U, Rattei T, et al. Phylogenetic and environmental diversity of DsrAB-type dissimilatory (bi) sulfite reductases [J]. The ISME Journal, 2015,9(5):1152-1165.

[19] 李萬超.東海泥質(zhì)區(qū)沉積物部分化學(xué)成分的組成特征及其對(duì)環(huán)境因素的響應(yīng) [D]. 青島:中國海洋大學(xué), 2008.

[20] 陳皓文,李培英,王 波.浙江-閩北陸架沉積物硫酸鹽還原菌及與生物地球化學(xué)因子關(guān)系的分析 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 20(4):478-452.

[21] Nie M, Meng W, Bo L. Effects of salt marsh invasion by Spartina alterniflora on sulfate-reducing bacteria in the Yangtze River estuary. China [J]. Ecological Engineering, 2009,35(12):1804-1808.

[22] Zhang Y, Zhen Y, Mi T, et al. Molecular characterization of sulfate-reducing bacteria community in surface sediments from the adjacent area of Changjiang Estuary [J]. Journal of Ocean University of China, 2016,15(1):107-116.

[23] He H, Zhen Y, Mi T, et al. Community composition and distribution of sulfate-and sulfite-reducing prokaryotes in sediments from the Changjiang estuary and adjacent East China Sea [J]. Estuarine, Coastal and Shelf Science, 2015,165:75-85.

[24] Liu J, Liu X, Wang M, et al. Bacterial and archaeal communities in sediments of the North Chinese Marginal Seas [J]. Microbial Ecology, 2015,70(1):105-117.

[25] 秦蘊(yùn)珊,趙一陽,陳麗蓉,等.東海地質(zhì) [M]. 北京:科學(xué)出版社, 1987.

[26] Dang H, Luan X W, Chen R, et al. Diversity, abundance and distribution of amoA-encoding archaea in deep-sea methane seep sediments of the Okhotsk Sea [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2010,72(3):370-385.

[27] Geets J, Borremans B, Diels L, et al. DsrB gene-based DGGE for community and diversity surveys of sulfate-reducing bacteria [J]. Journal of Microbiological Methods, 2006,66(2):194-205.

[28] Klappenbach J A, Saxman P R, Cole J R, et al. rrndb: the ribosomal RNA operon copy number database [J]. Nucleic Acids Research, 2001,29(1):181-184.

[29] Klein M, Friedrich M, Roger A J, et al. Multiple lateral transfersof dissimilatory sulfite reductase genes between major lineages of sulfate-reducing prokaryotes [J]. Journal of Bacteriology, 2001, 183(20):6028—6035.

[30] Wilms R, Sass H, K?pke B, et al. Methane and sulfate profiles within the subsurface of a tidal flat are reflected by the distribution of sulfate-reducing bacteria and methanogenic archaea [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2007,59(3):611-621.

[31] Schippers A, Neretin L N. Quantification of microbial communities in near-surface and deeply buried marine sediments on the Peru continental margin using real-time PCR [J]. Environmental Microbiology, 2006,8(7):1251-1260.

[32] Blazejak A, Schippers A. Real-time PCR quantification and diversity analysis of the functional genes aprA and dsrA of sulfate-reducing prokaryotes in marine sediments of the Peru continental margin and the Black Sea [J]. Frontiers in Microbiology, 2011,2(1):253-264.

[33] Kondo R, Shigematsu K, Kawahara N, et al. Abundance of sulphate-reducing bacteria in fish farm sediments along the coast of Japan and South Korea [J]. Fisheries Science, 2012,78(1):123-131.

[34] Jiang L, Zheng Y, Peng X, et al. Vertical distribution and diversity of sulfate-reducing prokaryotes in the Pearl River estuarine sediments, Southern China [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2009,70(2):249-262.

[35] Quillet L, Besaury L, Popova M, et al. Abundance, diversity and activity of sulfate-reducing prokaryotes in heavy metalcontaminated sediment from a salt marsh in the Medway Estuary (UK) [J]. Marine Biotechnology, 2012,14(3):363-381.

[36] Sahm K, MacGregor B J, J?rgensen B B, et al. Sulphate reduction and vertical distribution of sulphate-reducing bacteria quantified by rRNA slot-blot hybridization in a coastal marine sediment [J]. Environmental Microbiology, 1999,1:65—74.

[37] Sahm K, Knoblauch C, Amann R. Phylogenetic affiliation and quantification of psychrophilic sulfate-reducing isolates in marine Arctic sediments [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999,65(9):3976-3981.

[38] Ravenschlag K, Sahm K, Knoblauch C, et al. Community structure, cellular rRNA content, and activity of sulfate-reducing bacteria in marine arctic sediments [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(8):3592-3602.

[39] Knittel K, Boetius A, Lemke A, et al. Activity, distribution, and diversity of sulfate reducers and other bacteria in sediments above gas hydrate (Cascadia Margin, Oregon) [J]. Geomicrobiology Journal, 2003,20(4):269-294.

[40] Gittel A, Mu?mann M, Sass H, et al. Identity and abundance of active sulfate-reducing bacteria in deep tidal flat sediments determined by directed cultivation and CARD-FISH analysis [J]. Environmental Microbiology, 2008,10(10):2645-2658.

[41] 王海麗,楊季芳.象山港海域硫酸鹽還原菌的時(shí)空分布及其影響因素 [J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2011,30(12):2857-2862.

[42] Leloup J, Petit F, Boust D, et al. Dynamics of sulfate-reducing microorganisms (dsrAB genes) in two contrasting mudflats of the seine estuary (France) [J]. Microbial Ecology, 2004,50(3):307-314.

[43] Kondo R, Nedwell D B, Purdy K J, et al. Detection and enumeration of sulphate-reducing bacteria in estuarine sediments by competitive PCR [J]. Geomicrobiology Journal, 2004,21(3):145-157.

[44] Kawahara N, Shigematsu K, Miura S, et al. Distribution of sulfate-reducing bacteria in fish farm sediments on the coast of southern Fukui Prefecture, Japan [J]. Plankton and Benthos Research, 2007,3(1):42-45.

[45] 金翔龍.東海海洋地質(zhì) [M]. 北京:海洋出版社, 1992:185-215.

[46] 于培松,薛 斌,潘建明,等.長江口和東海海域沉積物粒徑對(duì)有機(jī)質(zhì)分布的影響 [J]. 海洋學(xué)研究, 2011,29(3):202-208.

[47] Bissett A, Bowman J, Burke C. Bacterial diversity in organicallyenriched fish farm sediments [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2006,55(1):48-56.

[48] Kawahara N, Shigematsu K, Miyadai T. Comparison of bacterial communities in fish farm sediments along an organic enrichment gradient [J]. Aquaculture, 2009,287(1/2):107-113.

[49] 高愛國,陳皓文,孫海青.北極沉積物中硫酸鹽還原菌與生物地球化學(xué)要素的相關(guān)分析 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2003,23(5):619-624.

[50] 張小李,劉海洪,陳開勛,等.硫酸鹽還原菌生長規(guī)律的研究 [J].西北大學(xué)學(xué)報(bào), 1999,29(5):397-402.

[51] Leloup J, Quillet L, Berthe T, et al. Diversity of the dsrAB (dissimilatory sulfite reductase) gene sequences retrieved from two contrasting mudflats of the Seine estuary, France. FEMS Microbiology Ecology, 2005,55(2):230-238.

[52] Kondo R, Purdy K J, de Queiroz Silva S, et al. Spatial dynamics of sulphate-reducing bacterial compositions in sediment along a salinity gradient in a UK estuary [J]. Microbes and Environments, 2007,22(1):11-19.

[53] Sorokin, D. Y., Kuenen, J. G., Muyzer, G. The microbial sulfur cycle at extremely haloalkaline conditions of soda lakes [J]. Frontiers in Microbiology, 2011,2(44):111-117.

[54] Sorokin D Y, Abbas B, Tourova T P, et al. Sulfate-dependent acetate oxidation under extremely natron-alkaline conditions by syntrophic associations from hypersaline soda lakes [J]. Microbiology, 2014,160(4):723-732.

致謝：天津大學(xué)魏皓教授提供CTD數(shù)據(jù),“科學(xué)3號(hào)”調(diào)查船全體工作人員為調(diào)查工作提供了大量幫助和支持,特此致謝.

Distribution of sulfate-reducing bacteria in surface sediments from East China Sea.

ZHANG Yu1,2,3, HE Hui2,3,4, MI Tie-zhu1,2,3, ZHEN Yu1,2,3*, FU Lu-lu2,3,4, CHEN Ye2,3,4(1.College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China；2.Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China；3.Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China；4.College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China). China Environmental Science, 2016,36(12)：3750～3758

Sulfate-reducing bacteria (SRB) are ubiquitous and quantitatively important members in many ecosystems, especially in marine sediments. In this study, the abundance and distribution of SRB was investigated in the surface sediments from East China Sea in April, July, August and October, 2011. A quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis targeted the dissimilatory sulfite reductase β subunit gene (dsrB), which encodes a key enzyme in the sulfate reduction pathway, was performed to assess the abundance of the SRB in the sediments. The abundance of SRB ranged from 1.87×105to 4.69×108cells per gram wet weight sediment, with the lowest and the highest value in April and July, respectively. The ratios of SRB to total bacteria varied from around 0.0039%～1.6176%, which implied that SRB constituted a very small proportion of the total bacteria. The abundance of SRB in the southern areas was higher than that in the northern areas, and the abundance of SRB in the mud area was much higher than that in the non-mud area. In addition, statistical analysis demonstrated that temperature and dissolved oxygen concentration were important factors affecting the distribution of SRB abundance. This study presented the temporal and spatial distribution characteristics of SRB abundance, providing insights into understanding the carbon and sulfur biogeochemical cycles in the surface sediments from East China Sea.

East China Sea；sulfate-reducing bacteria；abundance；sediments

X172

A

1000-6923(2016)12-3750-09

張 玉(1987-),女,山東濟(jì)寧人,中國海洋大學(xué)博士研究生,主要從事海洋環(huán)境生態(tài)學(xué)方向的研究.

2016-04-25

國家自然科學(xué)基金(41521064,41620104001);中國科學(xué)院海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)開放基金(KLMEES201601)

* 責(zé)任作者, 副教授, zhenyu@ouc.edu.cn