煙酸聯(lián)合氯沙坦對兔動脈粥樣硬化斑塊ABCA1、SR-BI、MMP-1和MMP-9mRNA表達(dá)的影響

季寧寧 朱燕虹

煙酸聯(lián)合氯沙坦對兔動脈粥樣硬化斑塊ABCA1、SR-BI、MMP-1和MMP-9mRNA表達(dá)的影響

季寧寧 朱燕虹

目的 探討煙酸聯(lián)合氯沙坦對兔動脈粥樣硬化斑塊膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCAl）、B族I型清道夫受體（SR-BI）和細(xì)胞外基質(zhì)重建相關(guān)基因MMP-1、MMP-9mRNA表達(dá)的影響。方法50只兔分為正常對照組、動脈粥樣硬化模型組（模型組）、煙酸組、氯沙坦組和煙酸＋氯沙坦組（聯(lián)合治療組），每組10只。采取高脂飲食＋球囊損傷內(nèi)膜的方法建立動脈粥樣硬化模型，正常對照組喂以正常飼料，其余各組喂以高脂飼料，第9周起煙酸組、氯沙坦組和聯(lián)合治療組分別在高脂飼料中添加煙酸、氯沙坦、煙酸＋氯沙坦喂養(yǎng)，8周后檢測血脂水平，HE染色測量內(nèi)膜中層厚度（IMT），實時熒光定量PCR檢測ABCAl、SR-BI、MMP-1和MMP-9的mRNA表達(dá)。結(jié)果8周后與正常對照組比較，各高脂飼料喂養(yǎng)組TC、TG和LDL-C升高（均P＜0．01）。16周后與模型組比較，聯(lián)合治療組TC、TG和LDL-C降低，HDL-C升高，ABCAl和SR-BI mRNA表達(dá)增加，而MMP-1 mRNA表達(dá)降低（均P＜0．01）；主動脈IMT降低，MMP-9 mRNA表達(dá)也降低（均P＜0．05）。煙酸組HDL-C、ABCAl和SR-BI mRNA表達(dá)高于模型組，氯沙坦組MMP-9 mRNA表達(dá)低于模型組（均P＜0．05）。結(jié)論煙酸聯(lián)合氯沙坦可明顯改善血脂譜及穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊，上調(diào)ABCAl和SR-BI、降低MMP-1和MMP-9 mRNA的表達(dá)水平。

煙酸類 氯沙坦 動脈粥樣硬化 清道夫受體，B類 ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子 基質(zhì)金屬蛋白酶

動脈粥樣硬化（AS）是最常見的心血管疾病，也是最常見的致死和致殘原因。血脂代謝紊亂是AS的重要危險因素，巨噬細(xì)胞吞噬變性KDK形成的泡沫細(xì)胞堆積在血管內(nèi)膜是AS斑塊形成的基礎(chǔ)，而ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1（ABCA1）通過利用ATP將細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟進(jìn)行再循環(huán)或以膽酸形式排泄的過程稱作膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT），對AS斑塊細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流起著重要的調(diào)節(jié)作用，可以延緩甚至逆轉(zhuǎn)AS。RCT是受體介導(dǎo)的膽固醇外流過程，清道夫受體（SR-BI）作為HDK受體參與RCT，是重要的抗AS的受體[1-3]。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在AS形成和發(fā)展過程中起重要作用[4]。AS斑塊內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞聚集，合成MMPs增多是造成AS斑塊纖維帽變薄，斑塊不穩(wěn)定的重要機(jī)制[5]。煙酸能降低KDK和提高HDK水平，具有重要的調(diào)脂作用[6]；氯沙坦可以抑制血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘發(fā)的膠原蛋白和MMPs的活性，能夠穩(wěn)定AS斑塊[7]。本實驗通過高脂飲食+球囊損傷內(nèi)膜的方法建立兔AS模型，觀察煙酸聯(lián)合氯沙坦治療對兔AS斑塊ABCAl、SR-BI、MMP-1和MMP-9表達(dá)的影響，為AS的治療提供新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑 逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程大連有限公司，高脂飼料由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心合成，包括基礎(chǔ)飼料84%+豬油10%+蛋黃粉5%+膽固醇1%+膽酸鈉0.05%。

1.2 方法

1.2.1 分組和模型的制備 雄性健康新西蘭大白兔50只，3月齡以上，體重2.5～3.0kg；由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。普通飲食喂養(yǎng)，通過隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：正常對照組、AS模型組（模型組）、煙酸組、氯沙坦組、煙酸+氯沙坦組（聯(lián)合治療組），每組10只。除正常對照組外的其余各組通過耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1ml/kg）麻醉、肝素鈉（200U/kg）術(shù)中抗凝。參照文獻(xiàn)[8]建立兔AS模型：將深麻醉狀態(tài)下的兔固定在解剖臺上，右下肢備皮、常規(guī)消毒、鋪巾，分離右側(cè)股動脈約2cm并剪一小口，自切口處插入3.5F的冠狀動脈球囊導(dǎo)管約10～15cm，接壓力泵注入0.9%氯化鈉注射液，以10～12atm充盈球囊，緩慢回拉導(dǎo)管至切口處，重復(fù)操作3次，撤出球囊導(dǎo)管，結(jié)扎股動脈，分層縫合切口。術(shù)后每只家兔肌肉注射青霉素鈉8×105U/d，連續(xù)3d。術(shù)后第2天起模型組、煙酸組、氯沙坦組和聯(lián)合治療組改為高脂飼料喂食，150g/d，自由飲水，正常對照組仍為普通飼料喂養(yǎng)。第9周起煙酸組、氯沙坦組和聯(lián)合治療組分別在高脂飼料中添加煙酸（200mg·kg-1·d-1）、氯沙坦（20mg·kg-1·d-1）、煙酸+氯沙坦，繼續(xù)喂養(yǎng)8周。

1.2.2 血脂測定 實驗開始（0周）、第8周末（8周）及第16周末（16周）分別稱重，并從耳緣靜脈采血5ml，全自動生化分析儀測定血漿TG、TC、KDK-C和HDK-C水平。

1.2.3 形態(tài)學(xué)檢測 經(jīng)兔耳緣靜脈注入空氣處死所有實驗動物，仔細(xì)分離整個腹主動脈，生理鹽水漂洗后，切開管壁，予4%的多聚甲醛過夜固定，石蠟包埋，6μm切片，進(jìn)HE染色，Image pro-Plus 6.0測量斑塊內(nèi)中膜厚度，計算內(nèi)膜中層厚度（IMT）。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測ABCAl、SR-BI、MMP-1和MMP-9的mRNA表達(dá) 取腹主動脈約100mg，加入1ml總RNA提取試劑（TRIZOK），冰上勻漿，提取總RNA，并合成cDNA。ABCAl上游引物：5＇-TGAGCGAGTTCTTCGTTCCA-3＇，下游引物：5＇-GTCCCGAG ACTAT CC-AGCAA-3＇，擴(kuò)增目的片段長度136bp；SR-BI上游引物：5＇-TTTGCCGAGATGAACG-ACT-3＇，下游引物：5＇-AAGCGATAGGTGGGGAT-3＇，擴(kuò)增目的片段長度281bp；MMP1上游引物：5＇-TCAGTTCGTCCTCACTCCAG-3＇，下游引物：5＇-TTGGTCCACCTGTC ATCT TC-3＇，擴(kuò)增目的片段長度322bp；MMP9上游引物：5＇-GAGTACCTGTTCCGCTATGG-3＇，下游引物：5＇-GGCAGGTCTTCGGAGTAGTT-3＇，擴(kuò)增目的片段長度525bp；內(nèi)參β-actin：上游引物為5＇-GCAGTCGTTGGAGCGAGCAT-3＇，下游引物為5＇-ATG-GCATCTCACGATATT TGGA-3＇。反應(yīng)完成后得到Ct值，目的基因與β-actin的相對比值作為其表達(dá)量，采用2-ΔΔCt方法計算相對比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用KSD-t法。

2 結(jié)果

2.1 各組兔血脂的變化 模型組、氯沙坦組和聯(lián)合治療組各死亡1只，煙酸組死亡2只。各組兔在0、8及16周血脂變化見表1。

表1 各組兔血脂水平比較（mmol/K）

由表1可見，各組兔在0周血脂水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。8周時除正常對照組外各組TC、TG和KDK-C水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），均高于正常對照組（均P＜0.01）。與16周模型組比較，煙酸組HDK-C升高（P＜0.05）；聯(lián)合治療組TC、TG和KDK-C水平均降低，HDK-C水平升高（均P＜0.01）。

2.2 HE染色及IMT測定 各組兔腹主動脈內(nèi)膜染色見圖1，動脈內(nèi)膜、中膜厚度和IMT比較見表2。

圖1 各組兔腹主動脈HE染色結(jié)果（HE染色,×100）

表2 各組兔動脈內(nèi)膜、中膜厚度和IMT比較

由圖2可見，正常對照組兔腹主動脈血管壁內(nèi)膜、中膜、外膜3層結(jié)構(gòu)明顯,內(nèi)膜光滑完整，內(nèi)皮下無脂肪堆積，中膜平滑肌細(xì)胞細(xì)排列整齊；模型組兔腹主動脈內(nèi)膜增厚明顯,膠原纖維增生,內(nèi)皮下見脂肪堆積和泡沫細(xì)胞聚集,中膜平滑肌細(xì)胞增生，排列紊亂；聯(lián)合治療組兔主動脈內(nèi)膜病變較高脂組明顯減輕；煙酸組和氯沙坦組的病變介于模型組和聯(lián)合治療組之間。

由表2可見，與正常對照組比較，模型組、煙酸組、氯沙坦組和聯(lián)合治療組兔主動脈內(nèi)膜、中膜厚度和IMT均增加（均P＜0.01）。與模型組比較，煙酸組、氯沙坦組和聯(lián)合治療組兔主動脈內(nèi)膜厚度降低（均P＜0.01）。聯(lián)合治療組兔主動脈內(nèi)膜厚度低于煙酸組和氯沙坦組（P＜0.01或0.05），IMT低于模型組（P＜0.05）。

2.3 各組兔腹主動脈AS斑塊ABCAl、SR-BI、MMP-1和MMP-9的mRNA的表達(dá) 見表3。

表3 各組兔腹主動脈AS斑塊基因相對表達(dá)比較

由表3可見，與正常對照組比較，模型組ABCAl和SR-BI的mRNA表達(dá)降低（P＜0.01），MMP-1和MMP-9的mRNA的表達(dá)增加（P＜0.01或0.05）。與模型組比較，煙酸組ABCAl和SR-BI的mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）。氯沙坦組MMP-9的mRNA表達(dá)均低于模型組和煙酸組（均P＜0.05）。聯(lián)合治療組ABCAl的mRNA表達(dá)均高于模型組、煙酸組和氯沙坦組（P＜0.01或0.05），SR-BI的mRNA表達(dá)均高于模型組和氯沙坦組（均P＜0.01），MMP-1的mRNA表達(dá)均低于模型組、煙酸組和氯沙坦組（均P＜0.01），MMP-9的mRNA表達(dá)均低于模型組和煙酸組（均P＜0.05）。

3 討論

ABCA1通過利用ATP將細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇、磷脂及其他親脂分子通過胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)給貧脂的載脂蛋白A-1（ApoA-1），轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟完成RCT。SR-BI是RCT的積極分子，可將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至成熟的HDK，調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)。血脂代謝紊亂是AS形成的必要條件，而AS斑塊的不穩(wěn)定性是心血管事件關(guān)鍵因素[9]。MMPs是一組能特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶活化酶家族成員,主要由活化的巨噬細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，在AS斑塊中MMPs高表達(dá)能促進(jìn)組成AS斑塊纖維帽的間質(zhì)膠原成分降解，使斑塊纖維帽變薄易破裂，增加斑塊不穩(wěn)定性和心血管事件風(fēng)險[10-12]。

本實驗通過高脂飲食+球囊損傷內(nèi)膜的方法建立兔AS模型，發(fā)現(xiàn)模型組兔血液TC、TG和KDK-C明顯升高，腹主動脈內(nèi)膜、中膜增厚，IMT明顯升高，提示造模成功，該模型能較好反映AS病變。模型組兔腹主動脈ABCAl和SR-BI的mRNA的表達(dá)明顯降低，嚴(yán)重影響RCT，導(dǎo)致血脂代謝紊亂，血管內(nèi)膜脂質(zhì)沉積和AS斑塊形成；MMP-1和MMP-9的mRNA的表達(dá)顯著增加是AS斑塊不穩(wěn)定性增加的信號。MMPs降解纖維蛋白，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞其完整性，導(dǎo)致各種炎癥細(xì)胞浸潤、遷移，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答，引起斑塊纖維帽變薄，脂質(zhì)核心增大，容易破裂，不穩(wěn)定性增加。MMPs與血脂代謝紊亂綜合作用的結(jié)果是動脈內(nèi)膜、中膜增厚，IMT升高，其中動脈內(nèi)膜增厚主要是由于脂肪和泡沫細(xì)胞堆積而引起。煙酸具有調(diào)脂作用，主要是降低TG和提高HDK-C水平，改善血脂代謝紊亂，還具有抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮功能等作用[13]。本實驗中煙酸能提高HDK-C水平、上調(diào)ABCAl和SR-BI mRNA表達(dá)、降低動脈內(nèi)膜厚度，但程度不及聯(lián)合治療組。煙酸對TC、TG和KDK-C水平無明顯影響，提示煙酸主要通過加強(qiáng)RCT以降低動脈內(nèi)膜厚度。氯沙坦能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的MMP-9的表達(dá)并呈劑量依賴性，從而抑制MMPs對AS斑塊纖維帽的降解，具有穩(wěn)定斑塊的作用[7]。本實驗中，氯沙坦組MMP-9 mRNA的表達(dá)顯著低于模型組和煙酸組，提示氯沙坦能提高斑塊穩(wěn)定性。煙酸與氯沙坦聯(lián)合應(yīng)用能降低TC、TG和KDK-C水平，升高HDK-C，上調(diào)ABCAl和SR-BI mRNA表達(dá)，通過促進(jìn)RCT而減少血管內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，降低腹主動脈內(nèi)膜厚度和IMT；兩藥合用還能下調(diào)MMP-1和MMP-9的mRNA的表達(dá)，抑制纖維蛋白降解，在降低動脈內(nèi)膜厚度的同時抑制AS斑塊纖維帽的降解，提高斑塊穩(wěn)定性。值得注意的是聯(lián)合用藥的效果優(yōu)于兩藥單獨作用相加的效果，具體機(jī)制尚未清楚，有待進(jìn)一步研究。

（致謝：感謝廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心給予技術(shù)方面的幫助。）

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Effects of niacin plus losartan on mRNA expressions of ABCAl,SR-BI,MMP-1 and MMP-9 in atherosclerotic plaques of rabbits with atherosclerosis

JI Ningning. ZHU Yanhong. Deparment of Cardiology. Yiwu Central Hospital. Jinhua 322000. China

Objective To investigate the effects of niacin plus losartan on mRNA expressions of ABCAl,SR-BI,MMP-1 and MMP-9 in atherosclerotic plaques of rabbits with atherosclerosis．MethodsFifty rabbits were randomly divided into normal control group(CON group),atherosclerosis model group(AS group),niacin treatment group(NIA group),losartan treatment group (LOS group)and niacin plus losartan treatment group(N＋L group)with 10 rabbits in each group．Rabbits in AS,NIA,LOS and N＋L groups underwent balloon-induced arterial wall injury and then fed with high fat diet for 8 weeks;and rabbits in CON group were on a regular diet only．After 8 weeks the NIA group was given niacin 200 mg·kg-1·d-1,LOS group was given losartan 20 mg· kg-1·d-1,N＋L group was given niacin 200 mg·kg-1·d-1and losartan 20 mg·kg-1·d-1．The blood lipid levels were measured after 8 weeks．The animals were sacrificed by the end of 16 weeks and pathological examination was performed．The thickness ratio of the intima to media(IMT)was measured by HE staining．The mRNA expressions of ABCAl,SR-BI,MMP-1 and MMP-9 in atherosclerotic plaques were detected by RT-PCR．ResultsThe serum TC,TG and LDL-C levels,the aortic IMT were significantly higher in AS group than those in CON group．The mRNA expressions of ABCAl and SR-BI were significantly lower while the mRNA expressions of MMP-1 and MMP-9 were significantly higher in AS group than those in CON group(all P＜0．01)．The serum HDL-C 1evel and the mRNA expressions of ABCAl and SR-BI were significantly higher in NIA group than those in AS group (all P＜0．05)．The serum TC,TG and LDL-C levels were significantly lower while the serum HDL-C 1evels were significantly higher,the mRNA expressions of ABCAl and SR-BI were significantly higher while the mRNA expressions of MMP-1 and MMP-9 were significantly lower,and the aortic IMT was significantly lower in N+L group than those in AS group(all P＜0．05)．ConclusionNiacin plus losartan can significantly improve the lipid profile and stabilize the atherosclerotic plaques,up-regulatethe mRNA expressions of ABCAl and SR-BI,and down-regulate the mRNA expressions of MMP-1 and MMP-9 in rabbits with arthrosclerosis．

Nicotinoc acids Losartan Atherosclerosis Scavenger receptor,Class B ATP-binding cassette transporters Matrix metalloproteinases

2016-01-03）

（本文編輯：馬雯娜）

322000 義烏市中心醫(yī)院心內(nèi)科（季寧寧）；義烏市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科（朱燕虹）

季寧寧，E-mail：yanhong930@sina.com