高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定抗栓通絡(luò)丸中黃芪甲苷含量

王 紅，楊慈海，宋 軍，田平林

（1．湖北省荊門市婦幼保健院，湖北 荊門 448124； 2．湖北省荊門市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，湖北 荊門448124； 3．湖北省荊門市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 荊門 448000）

高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定抗栓通絡(luò)丸中黃芪甲苷含量

王 紅1，楊慈海2，宋 軍2，田平林3

（1．湖北省荊門市婦幼保健院，湖北 荊門 448124； 2．湖北省荊門市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所，湖北 荊門448124； 3．湖北省荊門市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 荊門 448000）

目的 建立測(cè)定抗栓通絡(luò)丸中黃芪甲苷含量的高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)（HPLC－ELSD）法。方法 色譜柱為 Lichrom C18柱（250 mm×4．6 mm，5 m），柱溫為30℃，流動(dòng)相為乙腈－水（32∶68），流速為1．0 m L／min。ELSD參數(shù)，氣體流速為2．0 mL／min，漂移管溫度為90℃。結(jié)果 黃芪甲苷進(jìn)樣量在0．778～3．89 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝0．999 9），平均回收率為99．02%，RSD＝1．43%（n＝9）。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可作為抗栓通絡(luò)丸的含量測(cè)定方法。

高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法；抗栓通絡(luò)丸；黃芪甲苷；含量測(cè)定

抗栓通絡(luò)丸由黃芪、丹參、赤芍、劉寄奴、桑枝、何首烏、桂枝、法半夏等21種中藥組方，是在傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上研制開發(fā)的中藥制劑，具有耐缺氧、抗疲勞、調(diào)節(jié)陰陽、增強(qiáng)免疫力等功效。原標(biāo)準(zhǔn)中無含量測(cè)定。黃芪為方中君藥，用量是其他藥味的3倍以上，故控制黃芪的含量非常重要。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分。本研究中參考文獻(xiàn)[1－6]，采用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)(HPLC－ELSD)法檢測(cè)制劑中黃芪甲苷的含量，為更好地控制制劑質(zhì)量提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）；Varian 380－LC型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；BP211D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司，d＝0．1mg）；DZKW型電子恒溫水浴鍋。抗栓通絡(luò)丸（湖北省荊門市中醫(yī)醫(yī)院，批號(hào)為20140415，20140708，20140901）；陰性樣品（自制）；黃芪甲苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110781－200613）；乙腈為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件[3]

色譜柱：Lichrom C18柱（250mm×4．6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈－水（32∶68）；流速：1．0mL／min；ELSD－ELSD參數(shù)，N2流速為2．0m L／min，氣化溫度為90℃，蒸發(fā)溫度為115℃。

2．2 溶液制備

稱取黃芪甲苷對(duì)照品19．45mg，精密稱定，置25mL棕色容量瓶中，加甲醇約20m L使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1m L含0．778mg黃芪甲苷的對(duì)照品貯備溶液。精密吸取對(duì)照品貯備溶液10mL，置50mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得每1 m L含0．155 6 mg黃芪甲苷的對(duì)照品溶液。取裝量差異下本品，研細(xì)，取粉末15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇100mL，浸泡過夜，水浴回流4 h，過濾；濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?5 mL微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40m L，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?mL使溶解，放冷；通過D101型大孔樹脂（內(nèi)徑1．5 cm，高15 cm），以50 mL水洗脫，棄去水液，再用40%乙醇40mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙庖浦?m L容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。按本品處方，取除黃芪外的其他藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取對(duì)照品貯備溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣10μL。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照品溶液（0．1556 g／L）5，10，15，20，25μL注入高效液相色譜儀，以對(duì)照品進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X）、色譜峰峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝1．530 4X－0．313 2，r＝0．999 9（n＝5）。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在0．778～3．89μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果黃芪甲苷峰面積的 RSD為1．71%（n＝5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，按2．2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果平均含量為0．085mg／g，RSD為1．96%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于0， 4，8，16，24 h時(shí)各進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果黃芪甲苷峰面積的 RSD為1．32%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批（批號(hào)為20140901，含量 0．105 mg／g）樣品細(xì)粉約 7．5 g，共9份，精密稱定，每3份為1組，分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液（0．155 6 g／L）4．0，5．0，6．0 mL，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2．4 樣品含量測(cè)定

取抗栓通絡(luò)丸3批，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密量取10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定并計(jì)算黃芪甲苷的含量。結(jié)果批號(hào)為 20140415，20140708，20140901的樣品中，黃芪甲苷的含量分別為 0．117，0．092，0．105mg／g，平均0．105mg／g。

3 討論

3．1 指標(biāo)成分選擇

方中黃芪屬君藥，用量大，測(cè)定黃芪甲苷的含量對(duì)控制制劑質(zhì)量有較大意義，故選用黃芪甲苷作指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定。

3．2 檢測(cè)方法確定

黃芪甲苷為皂苷類成分在紫外末端有吸收，干擾大，基線不穩(wěn)，ELSD為質(zhì)量通用型檢測(cè)器，重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好，且方法簡(jiǎn)便，易測(cè)定。

3．3 提取方法選擇

黃芪是原藥材入藥，用甲醇回流提取時(shí)間要充分，本試驗(yàn)中進(jìn)行了比較，回流1，2 h均不能提取完全，為保證黃芪甲苷提取充分，選用回流4 h。因處方中藥味較多，故干擾成分較多，對(duì)檢測(cè)結(jié)果有干擾，通過正丁醇提取后，再經(jīng)D101型大孔樹脂有選擇性地吸附和洗脫，能排除大多數(shù)雜質(zhì)的干擾，使黃芪甲苷得到較好分離。

[1]謝長(zhǎng)宏，段正富．抗栓通絡(luò)丸的制備及臨床應(yīng)用[J]．湖北中醫(yī)雜志，2011，33（2）：75－77．

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：283－284，581－582．

[3]高文平，李 拜，劉 成，等．高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定芪杞口服液中黃芪甲苷含量[J]．中國(guó)藥業(yè)，2014，23（1）：16－17．

[4]岳 莉．高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定腦絡(luò)通膠囊中黃芪甲苷含量[J]．中國(guó)藥業(yè)，2014，23（8）：33－35．

[5]宋 敏．HPLC－ELSD法測(cè)定婦安栓中黃芪甲苷含量[J]．中國(guó)藥房，2014，25（7）：647－648．

[6]馮傳平，楊 惠，狄慶鋒，等．HPLC－ELSD法測(cè)定補(bǔ)腎溫肺合劑中黃芪甲苷含量[J]．中國(guó)藥師，2014，17（2）：322－323．

Content Determ ination of AstragalosideⅣ in Kangshuan Tongluo Pills by HPLC－ELSD

Wang Hong1，Yang Cihai2，Song Jun2，Tian Pinglin3
（1．Jingmen Maternal and Child Health Hospital，Jingmen，Hubei，China 448124； 2．Jingmen Institute for Food and Drug Contorl，Jingmen，Hubei，China 448124； 3．Jingmen Traditional Medicine Hospital，Jingmen，Hubei，China 448000）

Ob jective To establish the content determination method of astragaloside Ⅳ in Kangshuan Tongluo Pills by HPLCELSD．M ethods The Lichrom－C18column（250 mm×4．6 mm，5μm）was adopted，the column temperature was 30℃，the mobile phase was acetonitrile－water（32∶68），the flow rate was 1．0 mL／min．The gas flow rate was 2．0 mL／min，the drift tube temperature was 90℃．Results The injection volume of astragalosideⅣshowed good linear relationship with the peak area in the range of 0．778－3．89μg（r＝0．999 9），the average recovery rate was 99．02%，RSD＝1．43%（n＝9）．Conclusion This method is simple to operate，it is rapid and accurate，and can be used as the quality control method of Kangshuan Tongluo Pills．

HPLC－ELSD；Kangshuan Tongluo Pills；astragalosideⅣ；content determination

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)04－0075－03

王紅（1967－），女，湖北荊州人，大學(xué)本科，副主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作，（電子信箱）

jzwh1967＠163．com；田平林（1962－），男，湖北荊門人，大學(xué)本科，主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┖丸b定，本文通訊作者，（電話）0724－2278195（電子信箱）gufangle＠sina．com。參考文獻(xiàn)：

2015－05－13；

2015－09－09)