不同時長的束縛應激致雌雄大鼠的抑郁樣行為改變

張北月，盧 聰，董黎明，徐 攀，何怡然,3，石晉麗，劉新民,3

(1. 中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3. 湖南中醫藥大學，長沙 410208 )

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研究報告

不同時長的束縛應激致雌雄大鼠的抑郁樣行為改變

張北月1,2，盧 聰1，董黎明1，徐 攀1，何怡然1,3，石晉麗2，劉新民1,3

(1. 中國醫學科學院藥用植物研究所，北京 100193；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3. 湖南中醫藥大學，長沙 410208 )

目的探討不同束縛時長的慢性束縛應激對雌雄SD大鼠抑郁樣行為的影響，為慢性束縛應激模型中實驗動物性別和實驗時長的選擇提供依據。方法對SD大鼠(雌雄各半)每天束縛 10 h和14 h，連續束縛28 d建立慢性束縛應激模型。采用體重監測、糖水偏愛實驗、自主活動實驗、新奇事物實驗等實驗方法，觀察不同束縛時長的慢性束縛應激對雌雄SD大鼠所致的抑郁樣行為。結果14 h/28 d CRS組雌雄大鼠的運動時間和中央區活動時間減少、糖水偏愛指數降低、對新奇事物探索潛伏期增多、探索時間和次數減少，這些實驗結果與對照組相比均有顯著差異。而10 h/28 d CRS組雌雄大鼠與對照組相比以上實驗結果僅個別指標有顯著性差異。在雌雄鼠比較中，14 h/28 d CRS雄性組的糖水偏愛指數顯著減少，對應的雌性大鼠卻未顯著減少。10 h/28 d CRS雄性組在中央區運動時間比對照組少、對新事物探索潛伏期明顯延長、探索時間縮短，而對應雌性大鼠無顯著性差異。結論14 h/28 d CRS雌雄鼠在糖水偏愛實驗、自主活動實驗、新奇事物實驗均顯著表現出抑郁樣行為。而10 h/28 d CRS僅雄性組表現出一定的抑郁樣行為的趨勢。慢性束縛應激更易致雄性大鼠產生抑郁樣行為。

慢性束縛應激；抑郁樣行為；束縛時長；Sprague-Dawley大鼠

抑郁癥是一種常見的精神疾病，患者常表現出情緒低落、消極、悲觀、內疚、注意力不集中、對事物失去興趣、睡眠和飲食障礙等特點，嚴重者甚至會產生自殺的想法[1]。據世界衛生組織報道，1990～2013年期間，患有抑郁癥和/或焦慮的人數上升了近50%，目前全球約共有3.5億名抑郁癥患者。抑郁癥是世界各地的首要致殘原因，2030年抑郁癥將成為導致全球疾病負擔的一個重大因素[2]。抑郁癥具有的高發病率、高復發率、高致殘/死亡率等特點，嚴重威脅著人類的健康。如何利用動物模擬人類抑郁癥狀，對于研究抑郁癥發病機制和抗抑郁藥物至關重要。慢性應激在抑郁癥發展中起著重要的作用[3]，通過動物對應激的反應建立抑郁動物模型是動物建模的原則之一[4]，本文即通過慢性束縛應激(chronic restraint stress，CRS)的方法模擬抑郁樣行為，并考察慢性束縛應激模型中不同的束縛時長和不同性別所致大鼠抑郁樣行為的差異，以期為CRS模型中實驗動物的性別和束縛時長的選擇提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器

大鼠行為束縛器(自制)、大鼠自主活動實驗實時檢測系統(中國航天員中心和中國醫學科學院藥用植物研究所聯合研制)。

1.1.2 實驗動物

清潔級Sprague-Dawley 大鼠，80只，雌雄各40只，體重：雌性120～140 g，雄性140～160 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：【SCXK(京)2012-0001】。動物飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所的屏障環境【SYXK(京)2013-0023】，12 h照明/12 h黑暗(照明：8:00～20:00)，飼養期間給予動物標準飼料和潔凈飲水。本動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

大鼠隨機各分為4組，每組雌雄大鼠各10只，分別為10 h/28 d C(Control，對照組)、10 h/28 d CRS(chronic restraint stress，CRS，慢性束縛應激組)、14 h/28 d C、14 h/28 d CRS。

1.2.2 慢性束縛應激模型的建立[5-6]

將CRS組大鼠置于聚酯透明材料所制的圓柱形束縛器內進行造模，隨時觀察動物行為狀態。束縛器長度為10～16 cm(可根據動物體積調節)，內徑為6 cm，周身有多個直徑為1 cm的通氣孔。10h/28d CRS組每天束縛10 h(8:00～18:00)，14 h/28 d CRS組每天束縛14 h(8:00～22:00)。束縛應激期間C組與CRS組均禁食禁水，束縛應激結束后CRS組大鼠撤除束縛器，各組都恢復飲食飲水。連續束縛應激28 d。

1.2.3 體重檢測

分別于第8、15、22、29、36、43、50 d稱量大鼠的體重。

1.2.4 糖水偏愛實驗[7-8]

糖水偏愛實驗分為訓練期和測試期。訓練期使動物適應糖水，測試期進行動物的糖水/純水消耗實驗，用糖水偏愛指數(糖水偏愛指數=糖水消耗/ 總液體消耗×100 %)評價動物對糖水的偏愛程度。在束縛應激前先進行糖水偏愛基線測試，即進行2 d的糖水適應，再禁食禁水1 d后，檢測每只大鼠在1 h內的糖水/純水的消耗量，并計算其糖水偏愛指數。束縛應激28 d后，再做一次糖水偏愛實驗，比較束縛應激前后大鼠的糖水偏愛指數的差異，以評價CRS各組動物的抑郁樣行為表現。

1.2.5 自主活動實驗[9-10]

利用大鼠自主活動實驗實時檢測系統進行實驗。自主活動測試箱為黑色不銹鋼材料制成的圓柱形桶，測試箱頂部敞開。采用圖像采集系統對測試大鼠的行為進行實時監測，再通過計算機系統對大鼠的自主活動信息進行數據處理。檢測時將大鼠面壁放入測試箱內，適應環境3 min后進行自主活動檢測，檢測時長為10 min，檢測時保持環境安靜。

1.2.6 新奇事物實驗[11-12]

于自主活動實驗次日將大鼠放入自主活動測試箱中測試。測試前在測試箱中央放入一個藍色的圓柱體新奇事物。實驗時將大鼠面向測試箱壁放入，并記錄10 min內首次探索新奇事物的時間(即潛伏期，10 min內無探索行為，則潛伏期時間記為10 min)、探索次數以及探索時間。

1.2.7 統計學處理

2 實驗結果

2.1 慢性束縛應激對于大鼠體重的改變

如表1所示，與對照組比較，從第15天開始，14 h/28 d CRS組雌性和雄性大鼠的體重均顯著下降(P<0.01)。而10 h/28 d CRS組雌雄性大鼠與對照組相比，體重無顯著性差異。

2.2 慢性束縛應激對大鼠糖水偏愛指數的影響

如表2所示，第1天糖水基線測試表明CRS組雌雄性大鼠各組間的糖水偏愛指數無差異。與糖水基線比較，14 h/28 d CRS雄性組糖水偏愛指數水平明顯下降(P<0.01)，而對照組無明顯差異。與對照組相比，14 h/28 d CRS雄性組的糖水偏愛指數及差值極顯著低于對照組 (P<0.01)。與糖水基線比較，14 h/28 d CRS雌性組糖水偏愛指數水平明顯下降(P<0.05)，而對照組無明顯差異。與對照組相比，14 h/28 d CRS組的糖水偏愛指數差值極顯著低于對照組 (P<0.01)。10 h/28 d CRS組雌雄大鼠與自身糖水基線及對照組相比，均沒有顯著性差異。

表1 慢性束縛應激對大鼠體重的影響Tab.1 The effect of chronic restraint on body weight of male and female rats

表2 慢性束縛對大鼠糖水偏愛指數的影響Tab.2 The effect of chronic restraint on the sucrose consumption index of male and female rats

2.3 慢性束縛應激對大鼠自主活動的影響

如表3所示，與對照組相比，14 h/28 d CRS組雄性大鼠的運動路程、運動時間、中央運動時間均極顯著減少(均P<0.01)，靜息時間顯著增加(P<0.05)。同樣，與對照組相比，14 h/28 d CRS組雌性大鼠CRS組的運動路程、運動時間、中央運動時間以及外周運動時間均極顯著減少(均P<0.01)，靜息時間顯著增加(P<0.01)。10 h/28 d CRS雄性組大鼠除在中央區運動時間比對照組少(P<0.05)，其他指標無顯著差異。10 h/28 d CRS雌性組的模型和對照組相比各指標均無顯著性差異。

2.4 慢性束縛應激對大鼠新奇事物探索行為的影響

如表4所示，14 h/28 d CRS組的雌雄性大鼠與對照組相比，潛伏期顯著升高(P<0.01)，探索次數、探索時間明顯下降(P<0.01)。14 h/28 d CRS雌性組的探索時間明顯比對應雄性組長(P<0.05)，而14 h/28 d C雌性對照組的探索時間明顯比對應的雄性組短(P<0.05)。10 h/28 d CRS雄性組大鼠的潛伏期顯著增長(P<0.05)，探索時間明顯減短(P<0.05)。10 h/28 d CRS雌性組大鼠僅潛伏期顯著增長(P<0.05)，探索次數及探索時間和對照組相比則無明顯變化。

表3 慢性束縛對大鼠自主活動的影響Tab.3 The effect of chronic restraint on behavior of male and female rats in the open-field test

表4 慢性束縛應激對大鼠在新奇事物實驗中探索行為的影響Tab.4 The effect of chronic restraint on explore behavior of male and female rats in the novel object test.

3 討論

慢性束縛應激(chronic restraint stress，CRS)作為一種非損傷性刺激，能有效地引起典型的非特異性應激反應，且與人類身心性疾病的致病過程有相似性[13-14]，是目前應用最廣泛的一種抑郁癥動物模型[15]，對于抑郁癥的病理生理研究具有重要意義。

研究報道，慢性應激抑郁模型會導致動物體重下降[16-17]，本研究中14 h/28 d CRS組雌雄大鼠與相應對照組比較體重顯著下降，而10 h/28 d CRS組大鼠無顯著性差異?？請鲎钤缬蒆all[18]設計而用于研究大鼠的情緒反應。一般認為抑郁動物的活動度減少，在陌生的環境里會減少對中央區域的探索。實驗中14 h/28 d CRS組雌雄大鼠運動路程和時間、中央區活動路程和時間等指標顯著減少，表明其對新奇環境好感度降低，表現出抑郁癥的特征。10 h/28 d CRS僅雄性組在中央區運動時間減少。機體獎賞系統的閾值增加，快感缺失為抑郁癥的一個主要的癥狀[19]，糖水偏愛實驗則是目前使用最為廣泛的一個用于評價快感缺失的動物行為學測試方法[20]，實驗中14 h/28 d CRS組動物糖水偏愛指數顯著降低表明其具有快感缺失的抑郁樣行為，而10 h/28 d CRS組雌雄大鼠與自身糖水基線及對照組相比均無顯著性差異。新奇事物實驗是研究動物自發探索行為的一種方法。動物在已熟悉的空場環境中面臨新奇事物時，產生既對新事物好奇又對新事物恐怖的矛盾沖突，出現接近-回避的沖突行為[21]。一般認為，抑郁動物在新奇事物實驗中的探索行為減少[22]，實驗中14 h/28 d CRS組的雌雄性大鼠與對照組相比探索次數、探索時間明顯下降，潛伏期時長顯著增多，表明動物對新奇環境的探究能力下降，其對事物失去興趣。10 h/28 d CRS組僅雄性大鼠的潛伏期明顯延長，探索時間縮短。

有文獻報道慢性應激刺激更易致雄性大鼠產生抑郁樣行為[23-24]，但也有文獻認為雌性大鼠對慢性應激更敏感[25]，同時還有文獻報道慢性應激對不同性別的大鼠所致的抑郁樣行為沒有差異[26-27]。而這些研究結果的矛盾可能是由于實驗中采用了不同的動物品系、應激手段和應激強度導致的，還需大量的實驗研究以促使應激模型的標準化。在本實驗雌雄鼠對比中，發現與對照組相比，14 h/28 d CRS雄性組的糖水偏愛指數及差值極顯著低于對照組 (P<0.01)，而雌性組僅糖水偏愛指數差值極顯著低于對照組 (P<0.01)。10 h/28 d CRS雄性組在中央區運動時間比對照組少(P<0.05)，而對應雌性組各指標均無顯著性差異。10 h/28 d CRS組雄性大鼠的潛伏期顯著延長(P<0.05)，探索時間明顯縮短(P<0.05)，而對應的雌性組大鼠僅潛伏期顯著延長(P<0.05)。這提示雄鼠可能對CRS更為敏感，更易表現出抑郁樣行為。

綜上，10 h/28 d CRS組雌雄大鼠與對照組相比，上述各實驗的結果僅有少數指標表現出顯著性差異，可能是由于束縛強度較弱，所以僅表現出一定的抑郁樣行為的趨勢。且10 h/28 d CRS組雌雄大鼠表現出一定的性別差異，雌性鼠對應激的的耐受力更強，CRS更易致雄性大鼠產生抑郁樣行為。而14 h/28 d CRS組能顯著表現出穩定的抑郁樣行為，性別差異對其無影響。因此，采用連續28 d、每天束縛14 h建立的抑郁癥動物模型是一種更穩定、更有效的抑郁模型。

[1] 郭雨欣,邢國剛.抑郁癥的生物學機制研究進展[J].中國神經精神病雜志,2012,38( 1) : 57.

[2] J.P. Lépine, M. Briley, The increasing burden of depression[J].Neuropsychiatr.Dis. Treat. 2011: 3-7.

[3] Hill M N, Hellemans K G C, Verma P,etal. Neurobiology of chronic mild stress: Parallels to major depression[J]. Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 2012, 36(9):2085-2117.

[4] Yan H C, Cao X, Das M,etal. Behavioral animal models of depression[J]. Neuroscience Bulletin, 2010, 26(4):327-337.

[5] Bowman R E, Ferguson D, Luine V N. Effects of chronic restraint stress and estradiol on open field activity, spatial memory, and monoaminergic neurotransmitters in ovariectomized rats[J]. Neuroscience, 2002, 113(2):401-410.

[6] Kim K S, Han P L. Optimization of chronic stress paradigms using anxiety- and depression- like behavioral parameters[J]. Journal of Neuroscience Research, 2006, 83(3):497-507.

[7] Willner P, Towell A, Sampson D,etal. Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress, and its restoration by a tricyclic antidepressant[J]. Psychopharmacology, 1987, 93(3):358-364.

[8] Chiba S, Numakawa T, Ninomiya M,etal. Chronic restraint stress causes anxiety- and depression-like behaviors, downregulates glucocorticoid receptor expression, and attenuates glutamate release induced by brain-derived neurotrophic factor in the prefrontal cortex[J]. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, 2012, 39(1):112-119.

[9] 王瓊,買文麗,李翊華,等.自主活動實時測試分析處理系統的建立與開心散鎮靜作用驗證 [J].中草藥,2009,40( 11) : 1773-1779.

[10] Chen G, Yang D, Yang Y,etal. Amino acid metabolic dysfunction revealed in the prefrontal cortex of a rat model of depression[J]. Behavioural Brain Research, 2015, 278:286-292.

[11] 薛濤,鄔麗莎,劉新民,等. 抑郁癥動物模型及評價方法研究進展[J].中國實驗動物學報,2015,23(03):321-326.

[12] Bienkowski P, Koros E, Kostowski W. Novelty-seeking behaviour and operant oral ethanol self-administration in Wistar rats.[J]. Alcohol & Alcoholism, 2001, 36(6):525-528.

[13] 遲強,許鵬,盧山,等.慢性束縛應激動物模型生物學特性及相關機制研究進展[J].臨床軍醫雜志,2013,12:1299-1301.

[14] 唐已婷,陳家旭.慢性束縛應激動物模型的研究進展(綜述)[J].北京中醫藥大學學報,2002, 01:25-28.

[15] Liu L, Zhou X, Zhang Y,etal. The identification of metabolic disturbances in the prefrontal cortex of the chronic restraint stress rat model of depression[J]. Behavioural brain research, 2016, 305:148-156.

[16] Ding Q, Li H, Tian X,etal. Zinc and imipramine reverse the depression-like behavior in mice induced by chronic restraint stress[J]. Journal of Affective Disorders, 2016, 197:100-106.

[17] 趙志宇,王衛星,郭洪祝,等. 甘草苷對抑郁模型大鼠體重及行為學的影響[J]. 中國心理衛生雜志,2006,12:787-790.

[18] Hall C S. Emotional behavior in the rat. I. Defecation and urination as measures of individual differences in emotionality[J]. Journal of Comparative & Physiological Psychology, 1934, 18(3):385-403.

[19] 黨海霞.穿梭計算機分析系統的建立和開心散改善抑郁癥認知功能研究[D].北京:中國醫學科學院藥用植物研究所,2008.

[20] Matthews K, Forbes N, Reid I C. Sucrose consumption as an hedonic measure following chronic unpredictable mild stress[J]. Physiology & Behavior, 1995, 57(2):241-248.

[21] Zimmermann A, Stauffacher M, Langhans W,etal. Enrichment-dependent differences in novelty exploration in rats can be explained by habituation[J]. Behavioural Brain Research, 2001, 121(121):11-20.

[22] Tatyana S, Rainer S, Dusan B,etal. Stress-induced anhedonia in mice is associated with deficits in forced swimming and exploration[J]. Neuropsychopharmacology Official Publication of the American College of Neuropsychopharmacology, 2004, 29(11):2007-2017.

[23] 汪麗佳.涉及單胺遞質代謝的抑郁癥性差異及其自殺行為研究[D].重慶醫科大學,2014.

[24] Kikusui T, Nakamura K, Mori Y. A review of the behavioral and neurochemical consequences of early weaning in rodents[J]. Applied Animal Behaviour Science, 2008, 110(1):73-83.

[25] 宋茜. mGluRs在產前應激對子代大鼠抑郁樣行為的作用及其調節機制研究[D]. 西北大學, 2011.

[26] 張麗,朱熊兆,白玫,等.不同應激方式引發的抑郁大鼠行為特征比較[J]. 中華行為醫學與腦科學雜志, 2012, 21(3):212-215.

[27] 江雪華,張敏,陸大祥,等.早期剝奪所致大鼠抑郁樣行為與海馬BDNF mRNA表達變化[J]. 心理學報, 2010, 42(6):695-703.

Depressive-like behavior of male and female rats induced by restraint stress with different restraint duration

ZHANG Bei-yue1,2, LU Cong1, DONG Li-ming1, XU Pan1,HE Yi-ran1,3,SHI Jin-li2, LIU Xin-min1

(1.Institute of medicinal plants, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193, China;2.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China;3.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China )

Objective To investigate the effects of chronic restraint stress on the depressive-like behavior of male and female SD rats with different restraint duration. Methods Sprague-Dawley rats (male and female) were subjected to restraint stress 10 h/14 h daily for 28 days. After that, sucrose preference test, open-field test, novel object test, were performed for all the rats to observe the effects of different restraint duration of chronic restraint stress on the depressive-like behaviors in male and female SD rats. Results For the 14 h/28 d CRS group, including male and female rats, the movement time and central activity time were reduced, sugar consumption index were decreased, novelty exploration time and frequency were reduced, latency were increased, numbers of nose pokes were reduced, and these results were significantly different compared with the control group. There were individual indicators that showed significantly difference for all the above-mentioned behavioral tests of the 10h/28 d CRS group. 14h/28 d CRS male group in syrup consumption index decreased significantly, the corresponding female rats did not significantly reduce. 10h/28 d CRS male group in the central motion time less than that of the control group, and latency was prolonged and exploration time was shortened, while the corresponding female rats had no significant difference. Conclusion 14 h/28 d CRS rats in the sucrose preference test, open-field test, novel object test were exhibited depressive-like behavior, but 10 h/28 d CRS male rats showed a trend of depressive-like behavior. Chronic restraint stress was more likely to lead to depressive-like behavior in male rats.

Chronic restraint stress; Depressive-like behavior; Restraint duration; Sprague-Dawley rats

全軍醫學科技“十二五”科研項目(BWS11J052)，新疆科技廳支疆項目(201491174)科技部國際科技合作專項 (2011DFA32730)。

張北月(1991-)，女，碩士生，研究方向：神經藥理，E-mail: 774156423@qq.com。

劉新民(1962-)，男，博士生導師，研究方向：神經藥理， E-mail: liuxinmin@ hotmail.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0018-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.004

2016-07-06