擠壓膨化脫脂處理對(duì)高溫豆粕制備蛋白多肽抗氧化性的影響

齊寶坤 隋曉楠 馬文君 王中江 丁 儉 李 楊 江連洲 王勝男

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

擠壓膨化脫脂處理對(duì)高溫豆粕制備蛋白多肽抗氧化性的影響

齊寶坤 隋曉楠 馬文君 王中江 丁 儉 李 楊 江連洲 王勝男

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

擠壓膨化 高溫豆粕 多肽 抗氧化性

高溫豆粕經(jīng)過不同蛋白酶水解可降解為可溶性蛋白和多肽的混合物，通過進(jìn)一步的分離純化得到的豆粕多肽具有溶解性高、黏度低、穩(wěn)定性強(qiáng)等功能特性及降血糖、降血壓等生理活性[1]。此外，豆粕多肽還具有良好的抗氧化性[2]。近年來擠壓膨化在油脂和生物活性肽的提取和制備方面都得到了較好的應(yīng)用[3]，在擠壓膨化過程中，高溫、高壓和高剪切作用，使物料的結(jié)構(gòu)和組織狀態(tài)發(fā)生變化，其中蛋白質(zhì)發(fā)生適度變性伸展，暴露出更多的作用位點(diǎn)，增加了對(duì)蛋白酶的敏感性，利于蛋白質(zhì)水解成多肽[4]。同時(shí)，擠出物的理化性質(zhì)和生物活性受到擠壓膨化中物理作用與化學(xué)作用的共同影響[5]。Choudhury 等[6]研究了雙螺桿擠壓技術(shù)在抗氧化性食品上的應(yīng)用，從顯微結(jié)構(gòu)上研究了膨脹比、剪切應(yīng)力、剪切強(qiáng)度、密度和粘度與抗氧化性的關(guān)系。江連洲等[7]采用擠壓膨化預(yù)處理水酶法提取大豆多肽，并應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)大豆擠壓膨化后水酶法提取多肽的最佳工藝進(jìn)行優(yōu)化，比相同酶解條件下未經(jīng)擠壓膨化預(yù)處理大豆多肽得率有顯著提高。

電子自旋共振(ESR)光譜儀，主要用于包含有未成對(duì)電子的順磁性物質(zhì)的研究，已在地質(zhì)學(xué)、物理學(xué)、生物醫(yī)藥學(xué)等方面得到了廣泛應(yīng)用[8]，特別是近些年來許多學(xué)者將ESR應(yīng)用于測定抗氧化劑對(duì)自由基的清除作用，該方法主要應(yīng)用于水溶性成分對(duì)自由基的清除活性。

為了提高豆粕蛋白資源的利用率，降低豆粕多肽的生產(chǎn)成本，提高豆粕多肽的抗氧化性，本試驗(yàn)利用酶法水解高溫豆粕制備豆粕多肽，再通過超濾處理分離出不同分子質(zhì)量的多肽，研究擠壓膨化脫脂處理對(duì)高溫豆粕制備蛋白多肽抗氧化性的影響，為高溫豆粕的綜合利用及抗氧化蛋白多肽的制備提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆片：哈爾濱市九三油廠；Alcalase 2.4L 堿性蛋白酶：novo公司；電子自旋捕獲劑(DMPO)：Sigma公司；其他試劑均為分析純。

雙螺桿擠壓機(jī)：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工試驗(yàn)室自制；F2102型植物試樣粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；LDZ5-2型臺(tái)式低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；LGJ-25型冷凍干燥機(jī)：上海醫(yī)用科學(xué)儀器廠；DU800型紫外分光光度計(jì)：美國貝克曼庫爾特有限公司；ESR 300E型波譜儀：德國布魯克公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

大豆片→擠壓膨化→脫脂→高溫脫溶→高溫豆粕→粉碎→豆粕粉→與水混合→酶解→滅酶→冷卻→調(diào)pH4.5→離心分離→豆粕多肽溶液→超濾→真空濃縮→冷凍干燥→豆粕多肽

將原料大豆片經(jīng)粉碎后，利用雙螺桿擠壓膨化機(jī)在不同條件下進(jìn)行擠壓膨化處理，然后采用乙醚對(duì)擠壓膨化后的大豆片進(jìn)行脫脂5 h，再放入90 ℃烘箱中高溫脫溶1 d得到高溫豆粕。將高溫豆粕粉碎后，以1:10的料液比與水混合，調(diào)節(jié)混合液溫度55 ℃、pH8.5，以20 000 U/g底物的加酶量加入Alcalase 2.4L堿性蛋白酶進(jìn)行酶解4.5 h，迅速升溫到90 ℃，滅酶10 min。然后冷卻至室溫，用1.0 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至4.5，4 000 r/min離心15 min，收集上清液即為豆粕多肽溶液。將豆粕多肽溶液依次通過分子質(zhì)量為1 ku和3 ku的平板膜。在室溫下，調(diào)節(jié)膜前壓力為1 MPa，膜后壓力為0.4 MPa，進(jìn)行超濾處理，分別得到P1(分子質(zhì)量>3 ku)、P2(分子質(zhì)量1～3 ku)、P3(分子質(zhì)量<1 ku)3種分子質(zhì)量的豆粕多肽溶液，然后真空濃縮、冷凍干燥即得豆粕多肽。多肽得率為35%左右，將得到的多肽配成10 μg/mL的溶液進(jìn)行抗氧化性分析。

1.2.2 擠壓膨化工藝單因素試驗(yàn)

1.2.3 擠壓膨化工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.2.4 豆粕多肽分子質(zhì)量對(duì)其抗氧化性的影響

將得到的不同分子質(zhì)量豆粕多肽P1(>3 ku)、P2(1～3 ku)、P3(<1 ku)，分別配成10 ug/mL的多肽溶液，以磷酸鹽緩沖溶液(PBS)作為對(duì)照，采用電子自旋共振(ESR)法測定豆粕多肽對(duì)·OH的清除作用。

1.3 測定方法

式中：A0表示空白組在波長322 nm的吸光度值；A1表示試樣組在波長322 nm的吸光度值。

1.3.2抑制脂過氧化自由基(ROO·)能力的測定

采用亞油酸脂質(zhì)過氧化體系法[10]。取50 μL多肽溶液與974 μL蒸餾水，26 μL亞油酸，2 mL無水乙醇，2 mL 50 mmol的pH 7.0的磷酸緩沖液混合，40 ℃暗處反應(yīng)12 h。取上述混合物50 μL加入0.8 mL的蒸餾水、0.2 mL 8.1% SDS、1.5 mL 20% pH 3.5的醋酸溶液、1.5 mL 0.8%巴比妥酸。將上述反應(yīng)液在100 ℃加熱60 min，冷卻，在532 nm處測定吸光度值，以空白作參比。抑制ROO·能力按公式計(jì)算：

式中：A0表示抗氧化劑空白樣的吸光度；AS表示加抗氧化劑樣品的吸光度。

1.3.3 電子自旋共振(ESR)法測定羥自由基(·OH)清除率

參照Rosen等[11]的方法。羥基自由基由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生。50 μL不同分子質(zhì)量豆粕多肽樣品或作為對(duì)照的等體積的pH7.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)加入到50 μL 0.3 mol/L的DMPO和50 μL 10 mmol/L硫酸亞鐵中，再加入50 μL 10 mmol/L過氧化氫溶液啟動(dòng)反應(yīng)。將反應(yīng)體系吸入密封的毛細(xì)管中，2.5 min后用Brucker ESR 300E波譜儀記錄ESR圖譜。測試條件：中心場強(qiáng)為351.194 mT，掃描寬度為10.00 mT，微波頻率為9.858 GHz，功率為2.25 mW。豆粕多肽對(duì)·OH的清除作用以清除率(%)表示，計(jì)算公式：

式中：HX為不同分子質(zhì)量豆粕多肽的ESR圖譜信號(hào)強(qiáng)度；H0為對(duì)照組的ESR圖譜信號(hào)強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0、Origin85和Design-Expert進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 擠壓膨化工藝單因素分析

圖1 物料含水量對(duì)高溫豆粕多肽抗氧化性的影響

圖2 套筒溫度對(duì)高溫豆粕多肽抗氧化性的影響

2.2 擠壓膨化工藝響應(yīng)面分析

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

表2(續(xù))

Y1=45.05+0.82A+1.16B+0.45C+0.55D+0.28AB+0.11AC+0.57AD+0.76BC+0.06BD-0.54CD-1.02A2-0.87B2-1.04C2-0.30D2

表清除能力的方差分析結(jié)果

抑制ROO·能力Y2通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型為：

Y2=49.97+0.74A+0.40B+1.15C+0.61D+0.24AB+0.14AC+0.44AD+0.64BC-0.64BD+0.13CD-0.93A2-1.02B2-0.77C2-0.34D2

采用Design-Expert軟件對(duì)方程進(jìn)行方差分析，抑制ROO·能力Y2的方差分析結(jié)果見表4。

表4 抑制ROO·能力的方差分析結(jié)果

由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，并且該模型R2=96.58%，說明96.58%的變化能通過這個(gè)模型解釋，試驗(yàn)誤差較小，模型成立，可以通過此模型對(duì)抑制ROO·能力進(jìn)行預(yù)測和分析。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為：C>A>D>B，即螺桿轉(zhuǎn)速>物料含水量>模孔孔徑>套筒溫度。

2.3 豆粕多肽分子質(zhì)量對(duì)其抗氧化性的影響

由圖3可以看出，波譜呈現(xiàn)出典型的ESR測定·OH清除率的標(biāo)準(zhǔn)四峰情況。ESR法測定·OH清除能力，主要是考察ESR波譜中的第2峰的高度與空白對(duì)照品第2峰高度之間的關(guān)系。波譜中的第2峰越高，則清除能力越差，反之，第2個(gè)峰的高度越低，說明其清除能力越強(qiáng)[14]。通過·OH清除率公式的計(jì)算可知，當(dāng)豆粕多肽分子質(zhì)量分別為>3 ku、1～3 ku、<1 ku時(shí)，·OH清除率分別為67.56%、93.13%、99.00%，可見·OH清除率與豆粕多肽分子質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。豆粕多肽分子質(zhì)量<1 ku時(shí)，·OH清除率幾乎達(dá)到100%，可見豆粕多肽對(duì)·OH有很好的清除能力，尤其是小分子質(zhì)量多肽的·OH清除能力尤為顯著。小分子質(zhì)量多肽比大分子質(zhì)量多肽具有更好的抗氧化活性，Saiyi Zhong等[15]研究表明，在其所研究的5個(gè)肽段中，小分子質(zhì)量肽展現(xiàn)出了更好的抗氧化活性，其抗氧化活性與維生素E相似。

圖3 不同分子質(zhì)量豆粕多肽的ESR圖譜

3 結(jié)論

[1]Schmidl M K, Taylor S L, Nordlee J A. Use of hydrolysatebased products in special medical diets[J]. Food Technology, 1994 10: 77-80

[2]俞偉輝, 陽建輝, 譚溪清，等. 酶法水解大豆蛋白的研究進(jìn)展[J]. 飼料與畜牧，2008(8):26-28

Yu Weihui, Yang Jianhui, Tan Xiqing, et al. Research progress for enzymatic hydrolysis of soybean protein[J]. Feed and Husbandry, 2008(8):26-28

[3]Stephanie J, Abdullah A M. Low temperature dry extrusion and high-pressure processing prior to enzyme-assisted aqueous extraction of full fat soybean flakes[J]. Food Chemistry, 2009，114: 947-954

[4]Lin Chen, Jianshe Chen, Jiaoyan Ren, et al. Modifications of soy protein isolates using combined extrusion pre-treatment and controlled enzymatic hydrolysis for improved emulsifying properties[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(5): 887-897

[5]Mary E C. Chemical and Nutritional Changes in Food during Extrusion. In: Mian N. Riaz, Ph. D. edited. Extruders in Food Application[C]. New York, Technomic Publishing Company, 2000：127-142

[6]Choudhury M H, Chakraborty R, Raychaudhuri U. Application of twin screw extrusion technology for development of new generation snacks with antioxidant: An analysis[J]. Advances in Polymer Technology, 2013, 12(29): 24-32

[7]江連洲, 隋曉楠, 齊寶坤，等. 酶法水解大豆膨化料提取多肽的工藝[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(14): 161-164

Jiang Lianzhou, Sui Xiaonan, Qi Baokun, et al. Enzymatic Extraction of Peptides from Extruded Soybean[J]. Food Science, 2011, 32(14): 161-164

[8]Cheng H Y, Lin T C, Yu K H, Yang, et al. Antioxidant and free radical scavenging activities of terminalia chebula[J]. Biol Pharm Bull, 2003, 26(9): 1331-1335

[9]王莉娟, 陶文沂. 大豆肽體外抗氧化活性研究[J]. 生物加工過程, 2008, 7(4): 69-73

Wang Lijuan, Tao Wenyi. Anti-oxidative effect of soybean peptides in vitro[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2008, 7(4): 69-73

[10]Huamin C, Koji M, Fumio Y. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. J Agric Food Chem, 1995，43: 574-578

[11]Rosen G M, Rauckman E J, Packer I L. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radicals[J]. Methods in Enzymology, 1984，105: 198-209

[12]Fujita Y, Noda Y. The effect of hydration on the thermal stability of ovalbumin as measured by means of differential scanning calorimetry[J]. Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1981 54: 3233-3234

[13]Petra B W. Investigation of absorption-induced structural changes of proteins at solid/liquid interfaces by differential scanning calorimetry[J]. Thermochimica Acta, 2002, 382(1-2): 174-188

[14]Park P J, Je J Y, Kim S K. Free radical scavenging activities of differently deacetylated chitosans using an ESR spectrometer[J]. Carbohydrate Polymers, 2004，55: 17-22

[15]Saiyi Z, Changwei M, Young C L, et al. Antioxidant properties of peptide fractions from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) processing by-product protein hydrolysates evaluated by electron spin resonance spectrometry[J]. Food Chemistry, 2011，126: 1636-1642.

Effect of Extrusion Degreasing Process on Antioxidative Activity of Peptides Prepared by High Temperature Soybean Meal

Qi Baokun Sui Xiaonan Ma Wenjun Wang Zhongjiang Ding Jian Li Yang Jiang Lianzhou Wang Shengnan

(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030)

extrusion, high temperature soybean meal, peptides, antioxidative activity

TS214.2

A

1003-0174(2016)12-0051-06

國家自然科學(xué)基金(31301501)，黑龍江省教育廳自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(12531049)，黑龍江省自然基金(QC2013C014)，黑龍江博士后科研啟動(dòng)金(LBH-Q13018)

2015-04-16

齊寶坤，男，1986年出生，博士，糧食油脂及植物蛋白工程

江連洲，男，1960年出生，教授，糧食油脂及植物蛋白工程