玉米內生細菌的動態分布及拮抗作用

農 倩， 唐照磊， 杜 青， 李石初

(1.廣西農業科學院玉米研究所，廣西南寧 530007；2.廣西農業科學院微生物研究所，廣西南寧 530007)

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玉米內生細菌的動態分布及拮抗作用

農 倩1,2， 唐照磊1， 杜 青1， 李石初1

(1.廣西農業科學院玉米研究所，廣西南寧 530007；2.廣西農業科學院微生物研究所，廣西南寧 530007)

[目的]比較不同品種及生育期玉米內生細菌的多樣性差異，對分離到的內生細菌的拮抗作用進行鑒定。[方法]以桂單0810、迪卡008、正大619玉米品種苗期和穗期的不同組織為研究對象，采用組織研磨勻漿方法分離培養內生細菌，結合形態生理特征和16S rDNA基因序列同源性比對分析對菌株進行了分類，并測定了所分離的菌株對4種玉米病原菌的拮抗作用。[結果]從桂單0810、迪卡008、正大619這3個玉米品種苗期和穗期的根、莖、葉中共分離到82株內生細菌，歸于4個屬，芽孢桿菌屬為優勢菌群，各菌群在不同生育期及組織的分布動態各有特點，其中有8株菌對4種玉米病原菌表現出不同程度的拮抗作用。[結論]玉米內生細菌的多樣性豐富，可作為玉米病害生防菌的來源。

玉米；內生細菌；動態分布；拮抗作用

植物內生細菌是指能在健康植物組織內棲居且對植物不造成危害并建立和諧聯合關系的細菌[1]。研究表明，內生細菌為植物微生態系統天然組成部分，其存在可提高植物對惡劣環境的適應性及促進寄主植物生長，還可作為潛在的內生拮抗細菌加以利用，減少化學農藥造成的環境污染，提高農田生態系統的多樣性，保持生態平衡[2]。植物內生細菌多樣性和群落結構不僅因作物種類不同而存在差異[3]，還隨著植物生長期、組織器官不同而有差別[4-5]。筆者以桂單0810、迪卡008、正大619這3個玉米品種苗期和穗期的不同組織為研究對象，采用組織研磨勻漿方法分離培養內生細菌，結合形態生理特征和16S rDNA基因序列同源性比對分析對菌株進行了分類，并測定了所分離的菌株對4種玉米病原菌的拮抗作用，旨在為玉米病害的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料玉米品種為桂單0810、迪卡008和正大619。細菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產品；TaqPCR Mix為北京全式金生物技術有限公司產品；Gene JET為Thermo Scientific 公司產品。

1.2 方法

1.2.1玉米種植與樣本采集。將玉米品種桂單0810、迪卡008和正大619植于廣西農業科學院明陽實驗基地，隨機區組排列，每個品種種植3個小區，每個小區5行，行長4.00 m，行距0.65 m，每行17株。于苗期和抽穗期進行樣本采集，采用5點取樣法，每點采4株。

1.2.2內生細菌的分離與純化。將樣本用自來水沖洗干凈，稱取根、莖、葉各1.0 g，75%乙醇表面消毒1 min，0.1%氯化汞消毒根3 min、莖2 min、葉片1 min，無菌水沖洗3次后，加10 mL無菌水研磨至勻漿，吸取最后一次沖洗液(作為對照)和勻漿各1 mL稀釋1 000倍，分別取1 mL稀釋液置于培養皿，倒入營養瓊脂(NA)固體培養基25 mL并混勻，28 ℃培養24～72 h。根據菌落的顏色和形態分類，計數，挑取菌落形態、色澤及培養基顏色等不同的菌株按常規方法純化，純化菌株轉接入含有80%甘油的離心管中，4 ℃保存備用。

1.2.3細菌形態學鑒定。形態學鑒定包括菌落外形觀察、革蘭氏染色和顯微鏡觀察[6]。

1.2.4細菌基因組DNA提取。使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，操作按說明書進行，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度及其完整性，-40 ℃保存備用。

1.2.5細菌16S rDNA的PCR擴增與測序。采用通用引物對細菌16S rDNA片段進行PCR擴增，上游引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增體系為20 μL，其中含10 μL 2×TaqPCR Mix,2 μL DNA,4 μmol/L上、下游引物各1 μL,6 μL雙蒸水。擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36個循環；72 ℃延伸10 min。使用Gene JET膠回收試劑盒回收PCR，委托上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.6序列生物信息分析。將獲得的16S rDNA序列與NCBI數據庫中已知序列進行同源性比對，采用基因序列分析軟件DNAMAN和系統發育樹構建軟件MEGA 7.0，與基因GenBank 數據庫中相關屬種基因序列進行系統發育樹分析[7]。

1.2.7拮抗作用鑒定。以玉米紋枯病、玉米大斑病、玉米小斑病和玉米莖腐病4種病原菌為供試病原菌，對分離到的內生細菌進行拮抗作用測試。采用平板對峙法，將已活化的直徑5 mm的病原菌塊接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板培養基中央，病原菌塊四周等距離接入分離到的菌株，28 ℃培養7 d后測量病原菌向拮抗菌方向的生長距離，以僅接種病原菌塊的平板為對照，計算抑菌率。

抑菌率=(對照病原菌菌落半徑-病原菌向拮抗菌方向生長距離)/對照病原菌菌落半徑×100%

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離數量及鑒定從苗期各組織樣本中分離獲得內生細菌36株，從穗期樣本中分離得到46株；從根中分離得到的菌株數量最多，為44株，莖中數量次之，為21株，葉中數量最少，為17株；從桂單0810獲得的菌株數量最多，為36株，迪卡008次之，為28株(表1)。對獲得的內生細菌進行形態學觀察、生理生化反應和16S rDNA序列比對分析發現，82株內生細菌分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)4個屬(圖1)，其中芽孢桿菌屬為優勢類群，菌株數量為52株，占總數的63.4%(表1)。

表1 不同生育期玉米各組織中分離到的內生細菌數量

2.2 內生細菌類群的變化隨著生育期變化，植株內生細菌種類也有所變化。其中，桂單0810、迪卡008從苗期到穗期的內生細菌種類有所增加，桂單0810苗期未分離到假單胞菌屬，但穗期階段獲得了假單胞菌屬；迪卡008苗期只含有芽孢桿菌屬和腸桿菌屬，穗期多分離到黃單胞菌屬和假單胞菌屬，正大619的內生細菌種類在不同生育期無變化(表2)。可見，不同品種的內生細菌種類變化情況存在差異。

表2 不同生育期內生細菌種類的變化

圖1 玉米內生細菌系統發育樹

2.3 內生細菌數量的變化分離計數發現，玉米植株內生細菌數量隨著生育期發展呈上升趨勢，其中桂單0810增幅最大，由苗期的1.983×104cfu/g增長至穗期的12.307×104cfu/g，增加了6.2倍。穗期各品種間的內生細菌總量差異達到顯著水平，表明不同品種間內生細菌的富集能力存在差異，桂單0810較其他2個品種更易誘捕到內生細菌定殖繁殖(表3)。

2.4 拮抗作用鑒定結果表明，82株內生細菌中，有8株對4種病原菌表現出不同程度的拮抗作用，其中菌株GD16對4種病原菌均表現出不同程度的拮抗作用(表4)。

表3 不同生育期各組織中內生細菌總量的變化

3 結論與討論

該研究結合形態學特征、生理生化特性和16S rDNA基因序列比對分析法對分離到的82株細菌進行鑒定。結果表明，玉米內生細菌的多樣性較豐富，共鑒定出芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、黃單胞菌屬、假單胞菌屬4個屬，以芽孢桿菌屬為主，這與前人的分離結果一致[8]。

玉米內生細菌的種類、數量與品種的遺傳背景及植株組織部位相關[5]。該研究表明，桂單0810和迪卡008均分離到4個屬的內生細菌，而正大619只分離到3個屬，其中桂單0810分離到的菌株數量最多，可能是該品種為當地選育品種，比較適應當地的生態環境和菌株的入侵。3個品種均表現為根組織中內生細菌的數量最大，莖和葉中數量次之，原因可能是由于根系統是內生細菌進入植物的入口，所以根聚集內生細菌比其他器官多[9]。在分離到的82株內生細菌中，有8株對玉米紋枯病菌等4種病原菌有拮抗作用，其中4株(GD08、GD16、ZD13、DK17)為芽孢桿菌屬，1株(DK27)為假單胞菌屬。芽孢桿菌在玉米中分布廣、菌量大，在玉米植株過程中具有穩定的內生特性，并能夠形成芽孢，抵抗外界不良環境，有些菌株對植物病害有較好的防治作用[10]。假單胞菌屬是作物中具有穩定溶磷效應的優勢菌種，分離自玉米的溶磷內生細菌，具有ACC脫氨酶活性，可以促進植株生長和防治植物病害[11]。并且假單胞菌能產生多種抗生素，改善植物營養，促進植物生長，并降解土壤中有毒物質，對植株促生及防病作用明顯[12]。因此，該研究對3個玉米品種內生細菌的分離鑒定可為進一步研究細菌種屬多樣性與玉米品種特性的關系，并獲得有益微生物資源奠定基礎。

表4 內生細菌對4種玉米病原菌的拮抗作用

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本刊提示 參考文獻只列主要的、公開發表的文獻，序號按文中出現先后編排。著錄格式(含標點)如下：(1)期刊——作者(不超過3人者全部寫出，超過者只寫前3位，后加“等”).文章題名[J].期刊名，年份，卷(期)：起止頁碼.(2)圖書——編著者.書名[M].版次(第一版不寫).出版地：出版者，出版年：起止頁碼.(3)論文集——析出文獻作者.題名[C]//.主編.論文集名.出版地：出版者，出版年：起止頁碼。

Dynamic Distribution and Antagonism of Endophytic Bacteria from Maize

NONG Qian1,2,TANG Zhao-lei1,DU Qing1et al (1.Maize Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning,Guangxi 530007; 2.Microbiology Research Institute of Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning,Guangxi 530007)

[Objective] The aim was to compare the endophytic bacteria diversity and antagonism function isolated from different maize varieties at different growth stages.[Method] With different tissues of Guidan0810,Dika008,Zhengda 619 at seedling stage and heading stage as research objects,endophytic bacteria were isolated and cultured by tissues homogenate.Strains were classified combined with morphological and physiological characteristics and sequence homology comparison of 16S rDNA gene,the antagonism ability of isolated strains to 4 maize pathogens were identified.[Result] Totally 82 strains which belonged to 4 genus were isolated from root,stem and leaf at seedling stage and heading stage of maize variety Guidan 0810,Dekarl 008 and Zhengda 619,and Bacillus was the dominant flora.The bacterial population composition was diverse from the growth stage and tissues.8 strains were showing antagonism ability to 4 pathogens.[Conclusion] The maize endophytic bacteria diversity is abundant,and can be the source of biocontrol bacterium for maize disease.

Maize; Endophytic bacteria; Dynamic distribution; Antagonism

廣西農業科學院基本業務專項(2014YQ25)；廣西自然科學基金項目(2014GXNSFBA118121)；廣西農業科學院玉米研究所科技發展基金項目(玉ZX2014007)。

農倩(1985- )，女，廣西河池人，助理研究員，碩士，從事植物內生微生物應用研究。

2016-09-14

S 182

A

0517-6611(2016)30-0003-04