白射干素對感染后咳嗽豚鼠細胞因子的影響

鄒桂欣，尤獻民，趙金明，王光函，李國信

（遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034）

論著

白射干素對感染后咳嗽豚鼠細胞因子的影響

鄒桂欣，尤獻民，趙金明，王光函，李國信

（遼寧省中醫藥研究院，遼寧 沈陽 110034）

目的觀察白射干素對感染后咳嗽（PIC）豚鼠肺泡灌洗液中細胞因子的影響。方法復制PIC豚鼠模型并收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），測定BALF中白細胞總數和分類計數，酶聯免疫吸附試驗測定細胞因子白介素-4（IL-4）和干擾素-γ（IFN-γ）水平。結果模型組豚鼠肺泡灌洗液中白細胞總數、中性粒細胞、淋巴細胞數及IL-4水平較空白組升高（P＜0.05）；IFN-γ水平較空白組降低（P＜0.05）。白射干素干預組可明顯降低PIC豚鼠BALF中白細胞總數、中性粒細胞、淋巴細胞及IL-4水平，同時升高IFN-γ水平，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論提示白射干素可能通過調控細胞因子而減少模型豚鼠氣道炎癥細胞的浸潤，發揮其抗炎、止咳作用。

感染后咳嗽；射干；白射干素；白介素-4；干擾素-γ

感染后咳嗽（post-infectious cough，PIC）又稱感冒后咳嗽[1]。目前認為呼吸道病毒及其他病原體，如細菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、百日咳桿菌等均可能引起感染后咳嗽，當同時存在≥2種病原體感染時，更易使咳嗽延遲不愈[2]。感冒后咳嗽的致病機制可能與氣道炎癥及上皮細胞的損傷有關。細菌感染是引發氣道炎癥的重要因素，革蘭陰性菌是呼吸道感染中主要的致病菌之一，而脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是決定革蘭陰性菌致病力的關鍵毒素[3]。目前，國內外學者多采用氣道內注射LPS法，復制動物氣道炎癥模型[4-6]。細胞因子在氣道炎癥發揮重要作用，其中白細胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）為Th2型細胞因子，是一種重要的炎癥表達因子，干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）為Th1型細胞因子，是一種調節細胞功能的小分子多肽，能調節機體的細胞免疫功能[7]，IL-4、IFN-γ以相互拮抗的方式，調節免疫球蛋白E（immunoglobulins E，IgE）的生成和分泌[8]。調整Thl/Th2平衡（增強Thl或抑制Th2活性），可能有助于氣道炎癥的治療。

射干（rhizoma belamcandae）作為治療喉痹咽痛的重要藥物，始載于《神農本草經》，具有清熱解毒、消痰、利咽的功效。前期研究結果提示，射干含有異黃酮成分，有抗炎、止咳等藥理活性作用[9-12]。射干藥材中所含白射干素是其抗炎、止咳的藥效物質基礎成分，因此本實驗采用LPS滴鼻法，復制動物慢性支氣管炎豚鼠模型，觀察白射干素對模型豚鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchio-loalveolar lavage fluids，BALF）中細胞因子的影響，以進一步探討其抗炎、止咳的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物豚鼠，雌性，體重300～450 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK（遼）2010-0001。

1.1.2 主要試劑與儀器白射干素（成都普瑞法科技有限公司，高效液相色譜法測定純度＞98.5%）；肺寧片（批號：140202，吉林吉春制藥股份有限公司），枸櫞酸（批號：20140415，國藥集團化學試劑有限公司）。IL-4、IFN-γ酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）。噴霧儀（EM99-002醫用空壓機，斯萊達醫療用品有限公司），日本Sysmex公司全自動模塊式血液體液分析（XN-1000），熏煙箱（自制），黃山牌香煙（焦油含量：11 mg，煙堿含量：1.2 mg，安徽中煙工業有限責任公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與模型復制豚鼠的飼養環境為溫度（20±2）℃，自由飲水，適應性飼養1周后，隨機分成6組，即空白組、模型組、白射干素低、中、高劑量組和陽性對照組（肺寧片），每組10只。首先迫使豚鼠慢性吸入香煙煙霧造成氣道高反應，用小劑量LPS滴鼻誘導豚鼠氣道炎癥，用枸櫞酸刺激法復制豚鼠咳嗽模型。具體操作如下：將豚鼠置熏煙箱中，以鋸末20 g+10支香煙點燃煙熏，30 min/次，1次/d，連續10d，自由進食吸水，于11、14和17 d用乙醚淺麻醉，鼻腔滴入LPS溶液，滴入量以1μl/g計算。于第12、 15和18天，將各組豚鼠置于透明密閉容器中，噴霧儀以4.5 mol/L枸櫞酸霧化溶液激發咳嗽，40 s/次，1次/d。

1.2.2 給藥方法于第19天開始灌胃，空白組、模型組生理鹽水溶液灌胃20 ml/kg，白射干素高劑量組給藥量為100 mg/（kg·d）[5.00 mg/（ml·d）]，白射干素中劑量組給藥量為50 mg/（kg·d）[2.50 mg/（ml·d）]，白射干素低劑量組給藥量為25 mg/（kg·d）[1.25 mg/（ml·d）]，肺寧片組每天給藥量為580 mg/（kg·d）[29.0 mg/（ml·d）]，灌胃1次/d，連續給藥5 d，給藥結束后測定豚鼠各觀察指標。

1.2.3 BALF收集分析將實驗豚鼠用2%戊巴比妥（25 mg/kg）麻醉后仰臥固定于操作臺，打開胸腔，暴露氣管和雙肺，結扎右主支氣管，在隆突上用套管針穿刺至左肺，緩慢注入無菌生理鹽水2 ml，停留30 s，回吸液體，重復3次，灌洗液回收率為70%～85%，用2層無菌紗布過濾，取灌洗液在1 200 r/min低溫離心10 min，棄上清液，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶解細胞沉淀，在全自動模塊式血液體液分析儀上測定白細胞總數、淋巴細胞計數及中性粒細胞計數，上清液置入-20℃冰箱保存，應用IL-4、IFN-γ檢測試劑盒，按試劑盒說明書用ELISA分別測定各檢測指標的濃度。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用格拉布斯準則剔除逸出值后，多組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BALF中白細胞總數和分類計數測定

2.1.1 白細胞總數的變化空白組、模型組、白射干素中、高劑量組及陽性對照組的白細胞總數比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=15.231，P=0.000）。兩兩比較結果，模型組與空白組的白細胞總數比較，經LSD-t檢驗，差異有統計學意義（t=8.074，P=0.000），模型組的白細胞總數升高；白射干素中、高劑量組與模型組的白細胞總數比較，經LSD-t檢驗，差異有統計意義（t=2.675和2.713，P=0.010和0.009），白射干素中、高劑量組的白細胞總數降低。

2.1.2 淋巴細胞計數的變化空白組、模型組、中高劑量白射干素組及陽性對照組的淋巴細胞計數比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=6.846，P= 0.000）。兩兩比較結果，模型組與空白組的淋巴細胞計數比較，經LSD-t檢驗，差異有統計學意義（t= 5.445，P=0.000），模型組的淋巴細胞計數升高；白射干素中、高劑量組與模型組的淋巴細胞計數比較，經LSD-t檢驗，差異有統計意義（t=2.674和3.178，P= 0.01和0.002），白射干素中、高劑量組的淋巴細胞計數降低。

2.1.3 中性粒細胞計數的變化空白組、模型組、中高劑量白射干素組及陽性對照組的中性粒細胞計數比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=14.990，P=0.000）。兩兩比較結果，模型組與空白組的中性粒細胞計數比較，經LSD-t檢驗，差異有統計學意義（t=8.024，P=0.000），模型組的中性粒細胞計數升高；白射干素中、高劑量組與模型組的中性粒細胞計數比較，經LSD-t檢驗，差異有統計意義（t=2.438和2.464，P=0.018和0.017），白射干素中、高劑量組的中性粒細胞計數降低，提示白射干素組有減少感染后咳嗽模型豚鼠BALF中白細胞總數、淋巴細胞及中性粒細胞的作用。見表1。

表1 各組BALF中白細胞總數和分類計數比較（n=10，×108/L±s）

表1 各組BALF中白細胞總數和分類計數比較（n=10，×108/L±s）

注：1）與空白組比較，P=0.000；2）與模型組比較，P＜0.01；3）與模型組比較，P＜0.05

組別白細胞總數淋巴細胞中性粒細胞空白組0.74±0.070.22±0.110.28±0.08模型組5.45±0.921）0.50±0.081）4.40±0.231）白射干素低劑量組4.50±1.240.44±0.093.52±0.82白射干素中劑量組4.21±1.652）0.38±0.152）3.35±1.333）白射干素高劑量組3.85±1.702）0.36±0.082）3.09±1.753）陽性對照組3.98±1.710.35±0.173.12±1.63 F值15.2316.84614.990 P值0.0000.0000.000

2.2 BALF中IL-4、IFN-γ水平

2.2.1 IL-4表達的變化空白組、模型組、中高劑量白射干素組及陽性對照組的IL-4含量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=3.804，P=0.005）。兩兩比較結果，模型組與空白組的IL-4含量比較，經LSD-t檢驗，差異有統計學意義（t=2.731，P=0.009），模型組的IL-4含量升高；白射干素高劑量組、陽性對照組與模型組的IL-4含量比較，經LSD-t檢驗，差異有統計意義（t=2.300和3.702，P=0.026和0.001），白射干素高劑量組、陽性對照組的IL-4含量降低。

2.2.2 IFN-γ表達的變化空白組、模型組、中高劑量白射干素組及陽性對照組的IFN-γ含量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=2.738，P= 0.028）。兩兩比較結果，模型組與空白組的IFN-γ含量比較，經LSD-t檢驗，差異有統計學意義（t=-3.151，P=0.003），模型組的IFN-γ含量降低；白射干素中劑量組、陽性對照組與模型組的IFN-γ含量比較，經LSD-t檢驗，差異有統計意義（t=-2.405和-3.166，P=0.020和0.003），白射干素中劑量組、陽性對照組的IFN-γ含量升高。提示白射干組有明顯降低感染后咳嗽模型豚鼠BALF中IL-4濃度，升高IFN-γ水平的作用。見表2。

表2 各組BALF中IL-4、IFN-γ水平比較（n=10，pg/ml±s）

表2 各組BALF中IL-4、IFN-γ水平比較（n=10，pg/ml±s）

注：1）與空白組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與模型組比較，P＜0.01

組別IL-4IFN-γ空白組77.12±9.6587.91±13.73模型組89.47±12.851）70.87±7.121）白射干素低劑量組83.11±10.0781.31±12.05白射干素中劑量組78.08±9.4084.28±10.262）白射干素高劑量組80.34±9.052）79.40±12.83陽性對照組73.97±9.213）84.14±13.633）F值3.8042.738 P值0.0050.028

3 討論

感染后咳嗽是一種較常見的呼吸道疾病之一，當病毒、細菌、支原體、衣原體或其他病原體感染后，呼吸道急性期癥狀消失，而咳嗽仍然遷延不愈，通常持續3～8周，胸片表現正常，常常能夠自愈，臨床上稱之為感冒后咳嗽。美國胸內科醫師學會公布《美國肺科醫師協會以循證為依據的感染后咳嗽的臨床實踐指南》，其中指出感染后咳嗽的致病機制可能與呼吸道廣泛的炎癥及上皮細胞的損傷有關。國內大多認為，氣道炎癥是氣道高反應引起咳嗽的決定性因素之一。病原體感染機體后，可使機體的免疫功能紊亂，細胞因子、炎性介質及炎癥細胞分泌或功能失調，引起炎癥網絡級聯反應，從而導致氣道阻塞性改變、反應性增高病理過程的發生。參與形成氣道炎癥反應的免疫因素涉及細胞因子、炎性介質、炎癥細胞3類物質，細胞因子如白介素，腫瘤壞死因子，轉化生長因子等；炎性介質主要有白三烯、組胺等；炎癥細胞包括肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞等[13]。T細胞活化后釋放生物活性物質，可引起不同程度的氣道上皮損傷和脫落，激發氣道炎癥，提高氣道反應性，刺激咳嗽發生，其主要分為Thl和Th2兩類，經典的Thl型細胞主要分泌IFN-γ、腫瘤壞死因子α和白介素-2，Th2細胞主要分泌的IL-4、白介素-5、白介素-13等細胞，可輔助B細胞促進IgE生成、嗜酸性粒細胞（Eosinophil，EOS）等炎癥細胞分化、募集、活化和黏液的高分泌，可介導包括支氣管哮喘在內的過敏性疾病的發生、發展。CD4+T細胞分泌的Th2細胞因子與哮喘氣道高反應性（airway hyper-reponsiveness，AHR）、氣道EOS浸潤和活化，以及血清IgE增高顯著相關[14]。Th1對Th2效應有拮抗作用。Thl/Th2功能失衡在氣道炎癥中的作用近年來備受關注，Thl/Th2失衡是氣道炎癥和氣道高反應性發生、發展的關鍵。正常情況下，Th1和Th2細胞處于相對平衡，維持機體正常免疫功能。當機體受到抗原刺激時，上述平衡被打破，Th1反應降低，Th2反應相應增加，即趨向于Th2優勢，使Th1/Th2失衡導致免疫反應性疾病的發生。而由Th1和Th2細胞分泌的兩種細胞因子IFN-γ和IL-4被認為在該病理過程中起關鍵作用[15]。Thl活性增強或Th2活性被抑制，均有可能改善氣道炎癥癥狀。

白射干素是射干止咳的藥效物質成分之一，對由枸櫞酸引咳的雌性豚鼠有一定的止咳作用。本實驗結果表明，白射干素有降低感染后咳嗽豚鼠肺泡灌洗液中白細胞總數和淋巴細胞的作用，能降低模型動物BALF中IL-4的含量，升高IFN-γ的表達水平，提示白射干素可能通過調節豚鼠BALF中Th1/ Th2平衡而發揮其抗炎、止咳藥理效應。

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（童穎丹 編輯）

Influences of dichotomitin on cytokines in guinea pig with post infectious cough

Gui-xin Zou,Xian-min You,Jin-ming Zhao,Guang-han Wang,Guo-xin Li
(Liaoning Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine,Shenyang, Liaoning 110034,China)

Objective To study the effect of dichotomitin on cytokines in post infectious cough(PIC)model of guinea pig.Methods PIC guinea pig model was established,dichotomitin was given at the same time.Total WBC number,lymphocytes and neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were detected.The levels of IFN-γ and IL-4 in BALF were detected by ELISA.Results In the mode group,the number of total WBC count,lymphocytes and neutrophils was increased,IL-4 level increased,IFN-γ level decreased(P＜0.05)in the BALF compared to the blank group.In the dichotomitin group,total WBC count,neutrophils,lymphocytes and the IL-4 level were obviously reduced,but IFN-γ level was increased(P＜0.05).Conclusions Dichotomitin might reduce infiltration of airway inflammatory cells of PIC model of guinea pig,and enhance the immunologic function.

post infectious cough;Rhizoma Belamcandae;dichotomitin;interleukin-4;interferon-γ

R259

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.002

1005-8982（2016）23-0006-04

2015-12-21