CTR1和ATP7B在人肺腺癌細胞A549的表達及其與順鉑耐藥的關系

羅霞，陳明偉

（1.新疆醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，新疆 烏魯木齊 830000；2.西安交通大學第一附屬醫院呼吸內科，陜西 西安 710061）

論著

CTR1和ATP7B在人肺腺癌細胞A549的表達及其與順鉑耐藥的關系

羅霞1，陳明偉2

（1.新疆醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，新疆 烏魯木齊 830000；2.西安交通大學第一附屬醫院呼吸內科，陜西 西安 710061）

目的探討人肺腺癌細胞株A549和肺腺癌順鉑耐藥細胞株A549/DDP對順鉑的耐藥機制。方法利用噻唑藍法檢測順鉑對A549/DDP及其親代細胞株的細胞毒作用和生長曲線的影響，探討A549/DDP細胞株凋亡敏感性的變化規律。采用Western blot檢測該細胞株銅離子轉運蛋白1（CTR1）、銅離子轉運磷酸化ATP酶（ATP7B）及聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）剪切蛋白表達，分析A549細胞對順鉑耐藥與CTR1、ATP7B及PARP剪切蛋白表達量的相關性。結果A549/DDP較其親代細胞株對順鉑引起的細胞毒性和凋亡敏感性下降；較其親代細胞株A549/DDP中ATP7B表達增加，CTR1表達降低。結論人肺腺癌細胞株A549對順鉑耐藥的產生與細胞凋亡敏感性降低有關，且細胞內ATP7B表達增加，CTR1表達降低，或可作為細胞對順鉑的增敏靶點。

順鉑耐藥；肺癌A549細胞株；銅轉運蛋白；銅離子轉運磷酸化ATP酶；銅離子轉運蛋白1

肺癌是最常見的一種惡性腫瘤，每年新發肺及支氣管癌達109.52萬，而死亡人數達95.10萬，位居各種癌癥第1位。接近70%肺癌患者在確診時已經是晚期或全身轉移。順鉑已被廣泛用于治療各種惡性腫瘤化療20多年。因其耐藥的發生，導致肺癌中僅＜20%的患者對化療有效。有關順鉑耐藥的機制，在前期研究中證實可能與鉑類藥物的轉運、解毒、DNA損傷，以及凋亡蛋白的發現等有關[1-2]，但具體機制尚不清楚。本研究選用人肺腺癌細胞株A549及其順鉑耐藥細胞株，觀察順鉑處理后，耐藥細胞和親代細胞對順鉑的細胞毒性、凋亡敏感性，以及銅離子轉運磷酸化ATP酶（copper transporting phosphorylated ATPase，ATP7B）、銅離子轉運蛋白1（copper transporters 1，CTR1）表達是否存在差異，進一步探討細胞耐藥機制，為臨床解決化療耐藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細胞株

無血清細胞凍存培養基（roswell park memorial institute-1640，RPMI 1640）、胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，兔抗人多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抗體、兔抗人ATP7B、CTR1抗體、鼠抗兔免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）二抗均購自美國CST公司，人A549肺癌細胞株、A549/順氯氨鉑[cis-Dichlorodiamineplatinum（Ⅱ），DDP]均購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。

1.2 細胞培養及噻唑藍檢測細胞增殖活力

各細胞株置于含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養液中，在37℃二氧化碳CO2體積分數為5%的飽和濕度條件下培養，取對數生長期細胞進行實驗。細胞密度調整為1×104個/ml，接種于96孔細胞培養板，100μl/孔。細胞株給予不同濃度的順鉑處理（終濃度依次為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00和32.00μg/ml），分別培養24和48 h后，加入試劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150μl，震蕩10 min，使噻唑藍[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]還原產物完全溶解。酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處檢測光密度（optical delnsity，OD）值，OD值代表活細胞數量。按以下公式計算細胞活力：細胞生存率（%）=（D實驗組-D空白對照）/（D對照組-D空白對照）×100%。半數抑制濃度IC50通過SPSS 16.0統計軟件計算，耐藥指數（resistance index，RI）=耐藥細胞株IC50/親代細胞株IC50。

1.3 Western blot檢測

收集對數生長期的各細胞株，分別用含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液裂解，提取蛋白并定量。聚氰基丙烯酸正丁酯法測定蛋白濃度后，以30μg總蛋白量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，用濕法轉膜至硝酸纖維素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上，轉膜后以5%～10%脫脂牛奶室溫封閉2 h，在1∶1 000濃度的PARP抗體，兔抗人ATP7B、CTR1抗體中溫育16 h，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗滌6次，1∶3 000濃度的鼠抗兔IgG二抗溫育1 h，洗膜，增強化學發光，顯影。以目的條帶與內參條帶灰度值的比值計算目的蛋白的相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩種細胞生長曲線差異用配對樣本t檢驗，兩組細胞不同藥物濃度對生存率變化趨勢分析采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 順鉑對耐藥細胞A549/DDP及其親代細胞A549的細胞毒性作用

A549/DDP及其親代細胞A549在分別在0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00和32.00μg/ml濃度順鉑作用48 h后，利用MTT法檢測A549/DDP與親代細胞A549的OD值，采用重復測量數據方差分析，結果：①不同濃度順鉑作用下，兩組細胞生存率有差別（F=24.829，P=0.000），②不同濃度對不同細胞的生存率影響有差異（F=24.829，P=0.000）。見附表。

利用MTT法檢測順鉑耐藥細胞株A549/DDP與親代細胞A549在順鉑處理48 h后細胞生存曲線，計算A549細胞株的IC50為（1.35±1.97），A549/ DDP細胞株的IC50為（13.77±3.54），RI為10.2。見圖1。

2.2 A549/DDP及其親代細胞A549的生長曲線

為觀察誘導細胞耐藥后，是否影響細胞的增殖速度，繪制耐藥細胞A549/DDP及其親代細胞A549的生長曲線。為比較兩組細胞增殖速度是否相同，以細胞密度為1×104個/ml，接種于96孔細胞培養板（共5個），100μl/孔，每天取1塊細胞培養板用MTT法測得OD值，5 d后，使用SPSS統計軟件對每天測得OD值采用配對樣本t檢驗，兩組細胞OD值比較，差異無統計學意義（t=0.968，自由度=4，雙側檢驗P=0.339），說明順鉑誘導耐藥后，細胞增殖未受影響，因此該細胞株適合用于順鉑耐藥性研究。見圖2。

附表A549/DDP與親代細胞A549在不同濃度順鉑作用下OD值比較（±s）

附表A549/DDP與親代細胞A549在不同濃度順鉑作用下OD值比較（±s）

細胞類型32.00μg/ml16.00μg/ml8.00μg/ml4.00μg/ml2.00μg/ml1.00μg/ml0.50μg/ml0.25μg/ml A5490.029±0.2620.055±0.2860.089±0.2730.188±0.350.459±0.2520.546±0.2360.683±0.1630.763±0.107 A549/DDP0.413±0.2730.473±0.2930.971±0.2620.620±0.3030.813±0.2400.894±0.2470.899±0.1530.929±0.117

圖1 順鉑耐藥細胞A549/DDP與親代細胞A549經順鉑處理48 h后細胞生存曲線

圖2 順鉑耐藥細胞A549/DDP與親代細胞A549 5 d內的生長曲線

2.3順鉑對耐藥細胞A549/DDP及其親代細胞A549凋亡敏感性的影響

將兩組細胞分別用不同濃度順鉑處理24 h后，提取蛋白，利用Western blot檢測PARP的剪切情況。人肺腺癌親代細胞株A549在2μg/ml順鉑濃度開始出現PARP剪切，而其順鉑耐藥細胞株A549/ DDP需要增加順鉑干預濃度，在16μg/ml時開始出現PARP剪切，且剪切片段的表達逐漸增強。根據A549/DDP發生PARP剪切濃度上升（陽性結果即可說明），說明人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP較其親代細胞株的凋亡敏感性下降。見圖3。

圖3 順鉑處理耐藥細胞株A549/DDP及其親代細胞A549 24 h后引起的PARP剪切

2.4順鉑對耐藥細胞A549/DDP及其親代細胞A549細胞膜上ATP7B表達的影響

利用Western blot檢測順鉑處理耐藥細胞株A549/DDP及其親代細胞A549經5μg/ml順鉑處理48h后ATP7B蛋白的表達水平。可見，經藥物處理后，人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP的ATP7B表達量較其親代細胞株明顯增加。見圖4。

圖4 順鉑處理耐藥細胞株A549/DDP及其親代細胞A549經5μg/ml順鉑處理48 h后ATP7B蛋白的表達水平

2.5順鉑對耐藥細胞A549/DDP及其親代細胞A549細胞膜上CTR1表達的影響

利用Western blot檢測A549/DDP細胞株及其親代細胞A549經15μg/ml順鉑處理5min后細胞膜CTR1蛋白的表達水平。可見，無順鉑干預時（0μg/ml），人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP中CTR1的表達量明顯少于其親代細胞株。而利用15μg/ml順鉑干預細胞5 min后，兩細胞細胞株的CTR1表達量較未行順鉑干預時并無明顯變化。見圖5。

圖5 順鉑處理耐藥細胞株A549/DDP及其親代細胞A549經15μg/ml順鉑處理5 min后CTR1蛋白的表達水平

3 討論

全身化療是目前大多數非小細胞肺癌患者的主要治療手段，而主要的鉑類方案有效率只有30%～47%。腫瘤細胞對抗癌藥物耐藥是臨床化療失敗的主要原因。克服腫瘤細胞耐藥性，提高抗癌藥物療效，是目前臨床上亟需解決的問題。然而腫瘤耐藥產生是一個多途徑、多環節、多重機制的過程，需深入研究以闡明其機制。

文獻中報道，人肺腺癌順鉑耐藥細胞株對順鉑的抗性是親代細胞的7.88倍[3]，在不含藥物的培養基中穩定培養幾個月耐藥性仍然不變化。本研究結果表明，人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP較其親代細胞株耐藥指數為10.2，本實驗中A549/DDP耐藥指數稍高于文獻報道數值，主要考慮與細胞實驗前用低濃度順鉑（2μg/ml）穩定培養2個月左右，增加了細胞的耐藥性。通過繪制A549、A549/DDP生長曲線，發現兩細胞株經過順鉑藥物誘導后，增殖速度未受到影響，因此認為該細胞株適合用于順鉑耐藥性研究。

PARP是一種重要的DNA修復基因，在細胞凋亡的研究中，可作為凋亡的標志。目前，對于PARP的單核苷酸多態性與腫瘤的易感性研究，主要集中在生殖系腫瘤、肺癌、乳腺癌等方面。其是堿基切除修復系統通路的核心成員之一，在維持基因組穩定性及調節轉錄方面發揮重要作用。研究表明，PARP的高度保守的接觸反應區存在的兩個多態性位點與吸煙的交叉作用可明顯增加肺癌的易感性[4]。PARP基因多態性與非小細胞肺癌鉑類化療敏感性相關尚無定論[5]。本實驗中A549細胞株在順鉑濃度2μg/ml是即出現PARP剪切，而在A549/DDP細胞株中，順鉑濃度達16μg/ml后出現PARP剪切，說明人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP對順鉑引起的凋亡敏感性減低。

順鉑的分子極性高，不易通過擴散方式穿過細胞膜，進入細胞。銅離子轉運蛋白家族包括銅離子轉運蛋白家族包括銅離子轉運蛋白和銅離子轉運磷酸化ATP酶。ATP7A和ATP7B是主要的銅離子泵出蛋白，兩者也參與轉運鉑類藥物出胞[6]。KOMATSU等[7]在調節鉑類藥物對細胞耐藥性研究中首次提出，ATP7B過度表達表現出對高濃度順鉑藥物的耐受性。鼠在體實驗發現，ATP7B降調節使腫瘤細胞生長減少40%，且會增加順鉑的化療效果[8]。非小細胞肺癌細胞異位種植試驗證實，ATP7B表達與順鉑耐藥有關，對順鉑耐藥細胞中ATP7A、ATP7B基因表達水平高于敏感細胞，可以作為非小細胞癌耐藥標記物[9]。YIN等[10]發現，在體外檢測21例確診肺癌的標本對鉑類藥的敏感性，采用逆轉錄聚合酶鏈反應監測ATP7B基因的表達，結果發現，鉑類耐藥的肺癌比鉑類敏感的肺癌ATP7B的表達要高。以上結果表明，ATP7B可能參與鉑類抗腫瘤藥物的泵出。本實驗中，人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP的ATP7B表達量較其親代細胞株增加，且隨著干預藥物濃度增高呈逐漸上升趨勢。

CTR1是主要的銅離子攝入蛋白，研究證實其參與鉑類抗腫瘤藥物的攝入。LEE等[11]采用RT-PCR檢測40例卵巢癌患者中CTR1和CTR2的表達水平，研究表明，CTR1的高表達是對鉑類藥高敏感和高生存率預后的預測因子之一，而CTR2的高表達與CTR1的低表達的卵巢癌患者對鉑類藥愈耐藥和生存期愈短。CHEN等[12]采用免疫組織化學法研究發現，54例初次接受鉑類化療的Ⅲ期非小細胞肺癌患者中，CTR1高表達的化療反應效果越好，PFS及OS越好，結果表明，CTR1不僅是一種獨立的鉑類化療的預測因子，也是一種很好的預后因子。XU等[13-14]對282例經過≥2周期以順鉑為基礎化療的非小細胞肺癌患者通過單核苷酸多態性研究發現，CTR1基因多態性rs7851395和rs12686377與非小細胞肺癌對順鉑耐藥相關，GT單體型的患者對順鉑耐藥性增加，而AG單體型患者生存期較長，同時發現非小細胞患者rs10981694為C等位基因時，對順鉑的敏感性和耳毒性均增加。文獻報道，哺乳動物CTR1在細胞內鉑類藥物積聚研究發現，CTR1促進藥物的入胞作用發揮于藥物吸收早期；CTR1缺失會減少早期順鉑的入胞，其藥物暴露的前5 min吸收減少81%[15]。本實驗中，不同濃度順鉑誘導下人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP的CTR1的表達量較其親代細胞株減少。但是15μg/ml順鉑干預細胞5 min后，兩細胞細胞株的CTR1表達量并無明顯變化。

總之，人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP細胞中ATP7B表達較其親代細胞增加，而CTR1表達較親代細胞降低，從而使細胞內順鉑蓄積減少，可以推斷肺癌細胞對順鉑的耐藥與細胞內ATP7B表達增加，CTR1表達降低相關，同時順鉑進出細胞可能對銅離子轉運通道存在一定的依賴性。銅離子轉運蛋白ATP7B、CTR1與肺腺癌細胞對順鉑耐藥存在明顯相關性，人肺腺癌耐藥細胞株A549/DDP的凋亡敏感性下降，該研究對臨床克服腫瘤細胞對順鉑耐藥有重要意義。

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（童穎丹 編輯）

Resistance to cisplatin is mediated by synergistic action of CTR1 and ATP7B in A549 cell linein vitro

Xia Luo1,Ming-wei Chen2
(1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi,Xinjiang 830000,China;2.Department of Respirology,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiao Tong University, Xi'an,Shannxi 710061,China)

Objective To study the mechanisms of cisplatin resistance of human lung adenocarcinoma cell lines A549 and A549/DDP.Methods Human lung adenocarcinoma A549 cells and a cisplatin-resistant derivative A549/DDP were treated with varying concentrations of cisplatin.The changes in cell growth, cytotoxicity and apoptosis were explored.Western blot was used to determine the expression of copper transporter 1(CTR1),copper transporting phosphorylated ATPase(ATP7B)and poly-ADP-ribose polymerase (PARP).The correlations of cisplatin resistance with CTR1,ATP7B and PARP were analyzed.Results Compared to the A549 cells,the A549/DDP cells were less sensitive to cisplatin-induced cytotoxicity and apoptosis.ATP7B expression increased but CTR1 expression decreased in the A549/DDP cells compared to the A 549 cells.Conclusions Our results demonstrate that reduced expression of the copper influx transporter CTR1 and overexpression of the copper efflux transporter ATP7B are responsible for the resistance of A549/ DDP cells to cisplatin.These results indicate well that the expression of ATP7B and CTR1 may provide markers for chemoresistance and chemosensitivity,respectively,to cisplatin-based chemotherapy.

cisplatin-resistance;lung adenocarcinoma cell line;copper transporters 1;copper transporting phosphorylated ATPase

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.006

1005-8982（2016）23-0027-05

2016-07-06

R91

A