人髓核細胞體外培養及凍存的實驗研究*

薛鵬舉，敖俊，趙利濤，郭明柯，呂海文，姬文慧，黃歡歡

（1.河南科技大學第二附屬醫院骨一科，河南 洛陽 471000；2.遵義醫學院脊柱外科，貴州 遵義 563003；3.河南科技大學第二附屬醫院麻醉科，河南 洛陽 471000；4.河南科技大學第二附屬醫院病理科，河南 洛陽 471000）

臨床論著

人髓核細胞體外培養及凍存的實驗研究*

薛鵬舉1，敖俊2，趙利濤1，郭明柯1，呂海文1，姬文慧3，黃歡歡4

（1.河南科技大學第二附屬醫院骨一科，河南 洛陽 471000；2.遵義醫學院脊柱外科，貴州 遵義 563003；3.河南科技大學第二附屬醫院麻醉科，河南 洛陽 471000；4.河南科技大學第二附屬醫院病理科，河南 洛陽 471000）

目的研究頸椎手術所取髓核組織培養髓核細胞的可行性，適合作為種子的代次，凍存復蘇是否影響其傳代。方法測量傳1～5代次髓核細胞免疫組織化學法照片光密度（OD）值，觀察胞質內Ⅱ型膠原蛋白含量的差異。通過噻唑藍（MTT）試驗觀察凍存（實驗組）與未凍存（對照組）髓核細胞增殖活力的差異。通過免疫組織化學法觀察凍存對髓核細胞胞質內Ⅱ型膠原蛋白含量的影響。結果①采用酶消化法可成功分離并培養出人髓核細胞，傳1、2代細胞形態呈短梭型、三角形或多邊形，傳3代以后，細胞形態逐漸變為長梭型。②Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學法測OD值，傳1與2代比較差異無統計學意義（P＞0.05）。③實驗組細胞胞質內Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學法測得OD值與對照組細胞比較，差異無統計學意義（P＞0.05），實驗組細胞與對照組細胞MTT比色法測OD值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論①經頸椎手術取得的髓核組織，可體外培養出髓核細胞，并可獲得傳代細胞。②傳1、2代髓核細胞胞質內Ⅱ型膠原蛋白含量差異較小，細胞形態分化不明顯，適宜做髓核組織工程學種子細胞。③凍存復蘇處理未能使髓核細胞胞質內Ⅱ型膠原蛋白含量減少，細胞增殖活力亦未降低。

髓核細胞；組織工程學；種子細胞；Ⅱ型膠原蛋白

腰腿痛的發病率正在不斷增高，現階段認為腰腿痛由椎間盤退行性變引起[1]。椎間盤退行性變存在高致殘率[2-3]。髓核細胞數降低、胞質Ⅱ型膠原蛋白降低是椎間盤退行性變重要原因[4]。傳統治療方法可能造成椎間不穩、椎體間植骨不融合、醫源性脊髓神經根損傷等后果[5]，而且治療費用對社會造成巨大的經濟負擔[6]。最新研究發現，組織工程學方法有望用于針對椎間盤退行性變的臨床治療[7]，椎間盤組織工程學日益成為研究熱點[8]。大量髓核細胞作為種子細胞是科研及臨床的必要條件[9]。但現階段多使用脊柱側凸矯形術中切除的椎間盤，來源有限。腰椎間盤突出癥患者雖較為常見，但患者年齡偏大，椎間盤內髓核組織存在老化及髓核細胞數量較少，體外培養困難。筆者發現臨床因創傷引起的頸椎骨折患者較多，許多患者選擇頸椎前路椎體次全切椎間植骨融合手術術式進行治療。本實驗采用酶消化法對所獲椎間盤髓核組織進行研究。

1 資料與方法

1.1 人髓核細胞來源

選取2013年5月-2013年12月遵義醫學院附屬醫院脊柱外科病區明確診斷為頸椎骨折，自愿選擇頸椎前路椎體次全切椎間植骨融合手術術式并具備手術指證的患者，年齡≤45歲。排除標準：①血常規、肝腎功能、凝血功能異常者；②肝炎、梅毒、艾滋病患者；③因腫瘤、結核等原因引起的病理性骨折。受試者知情同意后，頸椎前路手術中，用生理鹽水濕潤紗布，包裹術中取出頸椎間盤髓核組織，放入無菌標本袋中，采集標本后30 min內進入實驗程序。

1.2 主要實驗試劑

F12-達爾伯克必需基本培養基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）（美國Hyclone公司），磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）粉劑（北京中彬金橋公司），胰蛋白酶粉劑（北京索萊寶公司），Ⅱ型膠原蛋白酶粉劑（美國Sigma公司），4%多聚甲醛（北京博奧森生物工程有限公司），TritionⅩ-100（北京索萊寶公司），鼠抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體濃縮液（北京中彬金橋公司），免疫組織化學法試劑盒（北京中彬金橋公司），雙花扁豆凝集素顯色試劑盒（dolichos bifows agglutinin，DBA）（北京中彬金橋公司）；Clearmont封片劑（北京中彬金橋公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 人頸椎間盤髓核細胞的取材與體外培養實驗人員與納入的患者溝通，簽訂同意書。全身麻醉下X線C臂定位傷椎平面。常規消毒鋪巾，術者顯露至病椎臨近椎間盤，撐開釘固定椎間盤臨近椎體并適當撐開，尖刃刀切開椎間盤，髓核鉗夾出椎間盤纖維環及髓核組織，將組織用無菌生理鹽水紗布包裹，放入無菌的標本袋內，交予實驗人員。于30 min內運至細胞實驗室，進入實驗程序。用0.01 mol等滲PBS溶液反復沖洗術中所得組織表面血液，剪除纖維環，以及與髓核組織的交界組織，再用PBS反復沖洗髓核組織。將洗凈的髓核組織置于無菌彎盤內，并剪成小塊，體積約為1 mm3；用0.25%胰蛋白酶溶液3 ml，37℃消化20min。加入含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的完全培養基3 ml，使胰蛋白酶的消化停止，5000r/min離心5min，倒除上清液。加入0.2%濃度的Ⅱ型膠原酶溶液3 ml，于37℃下消化4 h后終止消化，通過120目不銹鋼網篩獲得濾液，1 000 r/min離心5min，倒除上清液。PBS溶液懸浮細胞，1000 r/min離心5 min，倒除上清液，加入2 ml完全培養基懸浮細胞。取19μl懸浮細胞液，加入1μl 4%臺盼蘭染液，常規細胞計數板在倒置相差顯微鏡中計數。用完全培養基稀釋細胞，調整密度為2×104個/ml時，將其移至25 cm2細胞培養瓶內。將培養瓶放置在孵箱中進行體外培養，培養條件為：37℃、5%二氧化碳CO2。5 d后為細胞第1次換液，此后每隔1 d換液1次，并在倒置相差顯微鏡鏡下觀察髓核細胞狀況。用0.25%胰蛋白酶溶液消化貼壁率＞80%的髓核細胞進行傳代。將原代細胞、傳2及傳4代細胞以1× 104個/ml為密度移入24孔板中繼續培養，獲得傳1代、傳3代和傳5代髓核細胞，于37℃、5%CO2孵箱中進行培養，每日消化3孔細胞。分別在第1～7天時，用血球計數板對髓核細胞計數，并據此繪制傳代細胞的生長曲線。每日于倒置相差顯微鏡下觀察傳代細胞培養情況，對處于傳代后生長對數期的髓核細胞進行于倒置相差顯微鏡拍照。

1.3.2 Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學法鑒定在6孔培養板的每個培養孔內放入蓋玻片，將傳1代細胞以2×104個/ml為密度培養，制備為傳2代細胞爬片，隔1 d換液，每日觀察培養的髓核細胞。細胞爬片以髓核細胞貼比率至30%為宜，用預彎的注射器針頭挑出爬片。滴加4%多聚甲醛覆蓋玻片，10 min后細胞爬片固定完畢。滴加2%TritionⅩ-100溶液，于37℃破膜10 min。應用免疫組織化學法染色試劑盒中山羊血清對髓核細胞爬片進行封閉，37℃條件下進行封閉10 min；加入經稀釋后的一抗工作液，以使鼠抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體與爬片上Ⅱ型膠原蛋白特異性結合，放置在4℃冰箱中，進行孵育過夜。加入免疫組織化學法染色試劑盒中辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗小鼠抗體工作液，37℃孵育15 min。使用DBA顯色試劑盒中稀釋后的DBA工作液，添加至液體覆蓋細胞爬片靜置15 min，滴加蘇木素染液靜置2 min，加入Clearmont進行封片處理。應用倒置相差顯微鏡觀察染色情況，并每張爬片上隨機選取10個視野進行拍照，胞質被染為黃棕色的細胞為髓核細胞。

1.3.3 細胞凍存與復蘇將原代髓核細胞按是否做凍存復蘇處理分為實驗組和對照組。實驗組細胞于-80℃冰箱中凍存2周后復蘇，繼續置于25 cm2培養瓶中培養，此時細胞為傳1代髓核細胞。對照組細胞為未經凍存復蘇的原代髓核細胞，繼續置于CO2孵箱中繼續培養2周后傳代，此時細胞為傳1代細胞。將兩組細胞分別制備成傳2代髓核細胞的細胞爬片，測量免疫組織化學法的平均光密度（optical density，OD）值；將兩組細胞以1×104個/ml分別培養到96孔培養板中，應用噻唑藍[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]比色法在酶標儀中測OD值。消化離心原代髓核細胞，應用1ml細胞凍存液稀釋髓核細胞，以1×106個/ml為密度移入凍存管內，在4℃、-20℃先后保存2 h后，置于-80℃冰箱冷凍保存。將實驗組凍存的原代髓核細胞從-80℃冰箱迅速取出，并立即使用37℃水浴鍋進行快速復蘇。待完全解凍后，將細胞以1× 104個/ml培養在25 cm2培養瓶中，可得到傳1代髓核。對照組細胞置于CO2孵箱中繼續傳代培養得到傳1代髓核細胞。處理后，將兩組分別制備傳2代細胞爬片，應用Ⅱ型膠原蛋白為目的蛋白，行免疫組織化學法進行顯色。將兩組細胞以1×104個/ml分別培養在96孔培養板中，用MTT比色法測傳2代細胞增殖活力。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量平均每個髓核細胞OD值。在Image-Pro Plus 6.0軟件中打開免疫組織化學法顯色后的照片。在校準選項中選擇強度選擇標準OD曲線，在分割中吸取細胞內黃棕色區域，在測量指標選項中選擇平均OD值，查看選項中點擊統計得出的平均OD值。分別測量傳1～5代的髓核細胞爬片免疫組織化學法照片中髓核細胞的OD值；分別測量兩組傳2代細胞爬片髓核細胞的OD值。

1.3.4 MTT比色法測OD值MTT比色法檢測兩組傳2代細胞的增殖能力。兩分別用細胞計數板計數，完全培養基稀釋至1×104個/ml濃度的髓核細胞懸液。以每孔100μl細胞懸液用移液器培養在96孔的培養板中，置于CO2孵箱，以37℃、5%CO2為條件培養，每日換液，換液時每孔加完全培養基150μl。培養48 h后，單個培養孔內添加20μl MTT工作液。以37℃、5%CO2為條件孵箱內培養4 h。用移液器吸凈各孔培養液，并避免將培養孔底部形成的結晶吸出，單個培養孔內打入150μl二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）液。使用搖床調整為低速狀態下，進行震蕩大約10 min，溶解培養孔底部結晶物質。應用酶標儀在490 nm波長條件下，測各孔OD值，記錄結果。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，不同代次的OD值比較，用單因素方差分析，兩兩比較用SNK法；兩組標本密度值和OD值的比較，用兩獨立樣本的t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 髓核細胞鑒定

細胞形態呈短梭形或多邊形，胞質內可見散在深色顆粒，細胞核較大形態明顯（見圖1A）。采用Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學法對傳2代細胞進行鑒定，胞內顯色為黃棕色為陽性，證實是髓核細胞（見圖1B），設置同代次未添加一抗鼠抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體的細胞爬片作陰性對照（見圖1C）。

圖1 髓核細胞形態學特征及免疫組織化學法鑒定（倒置相差顯微鏡及免疫組織化學法染色）

2.2 原代髓核細胞生長特點

酶消化法獲得的原代細胞，需5 d才能觀察到極少細胞的貼壁現象（見圖2A）。但因為貼壁量少，使獲得的傳代和增殖的細胞種類純凈。第9天后細胞增殖迅速（見圖2B），15 d細胞整體貼壁率＞80%，局部細胞聚集（見圖2C）。由傳代髓核細胞生長曲線圖可見，傳代后第5天正處于細胞生長的對數期，故取第5天的髓核細胞拍照觀察其形態學特征，且當髓核細胞持續傳代使代次增加，其生長速度將變慢。傳1、3和5代細胞較原代髓核細胞貼壁速度加快，1 d以內可以貼壁。形態學上傳1代髓核細胞尚無形態變化，仍呈短梭形（見圖2D）。部分傳3代髓核細胞形態由短梭形變為長梭形（見圖2E）。傳5代髓核細胞長梭形細胞大量出現，胞質區域變小，增殖緩慢（見圖2F）。

圖2 原代與傳代髓核細胞生長特點（倒置相差顯微鏡×100）

2.3 不同代次髓核細胞的OD值

不同代次髓核細胞的OD值比較，經SNK法檢驗，差異有統計學意義（F=8.745，P=0.000）。傳1與傳2代之間髓核細胞OD值接近，差異無統計學意義（P=0.192），傳3、4和5代之間髓核細胞OD值接近，差異無統計學意義（P=0.411）。見附表和圖3。

附表不同代次髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白含量比較（n=30±s）

附表不同代次髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白含量比較（n=30±s）

組別Ⅱ型膠原蛋白傳1代0.195±0.075傳2代0.181±0.060傳3代0.143±0.081傳4代0.123±0.064傳5代0.113±0.048

圖3 不同代次髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白含量OD值比較（±s）

2.4 凍存復蘇處理對髓核細胞的影響

2.4.1 凍存復蘇處理后細胞與未處理細胞的形態學比較未凍存復蘇的傳1代細胞生長呈短梭形或多邊形（見圖4A）；用倒置相差顯微鏡下可見凍存復蘇后的髓核細胞形態仍呈短梭形或多邊形（見圖4B）。復蘇后的細胞與未凍存復蘇的髓核細胞形態特點比較，無明顯變化。

圖4 凍存復蘇處理后細胞較未處理的細胞的形態學比較（倒置相差顯微鏡×100）

2.4.2 MTT比色法檢測的OD值凍存復蘇處理的與未凍存復蘇處理的髓核細胞OD值接近，實驗組OD值為（0.180±0.045），對照組細胞OD值為（0.182±0.048），兩組增殖能力比較，差異無統計學意義（t=0.133，P=0.895）。

2.4.3 免疫組織化學法顯色的OD值凍存復蘇處理與未凍存復蘇處理的髓核細胞OD值接近，實驗組OD值為（0.172±0.070），對照組細胞OD值為（0.183±0.071），兩組胞質內Ⅱ型膠原蛋白含量比較，差異無統計學意義（t=0.499，P=0.620）。

3 討論

本研究發現，經頸椎前路手術取得的髓核組織，可體外培養出的髓核細胞，并可獲得傳代細胞。傳1、2代髓核細胞胞質內Ⅱ型膠原蛋白含量差異較小，細胞形態分化不明顯，可能適宜做髓核組織工程學研究的種子細胞。凍存復蘇處理未能使髓核細胞胞質內Ⅱ型膠原蛋白含量減少，細胞增殖活力亦未降低。

目前，治療椎間盤退變方法包括牽引等非手術保守治療，以及椎間盤摘除術、椎間融合術等手術治療。近來來，國內外研究集中在采用組織工程學技術直接修復髓核，使椎間盤退行性變逆轉。MEISEL等[10]成功延遲椎間盤退行性變進程。研究兔源性髓核細胞移植的WATANABE等[11]發現，髓核細胞移植可以使退變的椎間盤恢復同種異體椎間盤高度。髓核細胞合成Ⅱ型膠原蛋白能力下降，是椎間盤結構變化和功能減退的關鍵[12]。IWASHINA等[13]使用腺病毒SV40改善髓核組織內蛋白成分。然而，椎間盤種子細胞尤其是人髓核細胞培養較為困難[14]。髓核細胞本身在培養過程中，常常出現過早過多的老化現象[15]。髓核細胞從細胞分類上其實是一種類軟骨細胞[16]。若持續傳代則出現纖維樣變，與原代細胞形態相差較大[17]。利用間充質干細胞分化誘導的特性，可能培養出大量的類似髓核細胞特征的細胞。韋葛堇等[18]發現骨髓間充質具備這一特性。而即使在非接觸共培養的條件下，臍帶間充質干細胞也有向髓核細胞分化的潛能[19]。方煌等[20]應用脂肪源性干細胞培養出椎間盤細胞。本研究成功從頸椎骨折且需頸椎前路手術患者的椎間盤組織提取分離出髓核細胞，一定程度上解決髓核組織來源匱乏的問題。該類組織來源的患者年齡不高，未發生椎間盤退行性變，髓核組織內髓核細胞量較多，且未發生髓核細胞的過度老化，仍有較強的增殖能力，具備合成和分泌Ⅱ型膠原蛋白等細胞外基質的能力。張榮峰等[21]用MTT比色法測不同代次髓核細胞增殖能力，發現傳3代以后的髓核細胞的增殖能力明顯下降。但未有文獻對人各傳代代次髓核細胞內Ⅱ型膠原蛋白水平進行檢測。凍存是否影響髓核細胞增殖及Ⅱ型膠原蛋白表達亦未見文獻報道。本研究通過比較不同代次體外培養的髓核細胞免疫組織化學法測得OD值的差異，可見傳1、2代可用于做椎間盤組織工程學研究的種子細胞。凍存復蘇處理并不能改變髓核細胞形態學特點、增殖活力及Ⅱ型膠原蛋白合成能力，可以正常傳代，為椎間盤組織工程學優良種子細胞提供更廣的來源，并為其存儲方案提供實驗依據。

關于髓核細胞的研究需要進一步完善的地方還有很多，如依據現有文獻，涉及髓核細胞鑒定部分采用Ⅱ型膠原蛋白免疫組織化學法進行鑒定[22]。該方法雖然簡便可靠，但是鑒定方法單一，有關髓核細胞的其他鑒定方法本身就是一個課題。除本文討論部分提及的與干細胞共培養的基礎研究方向，臨床上還可以在倫理學許可基礎上，使用干細胞經椎間孔鏡入路植入椎間盤等方法，嘗試治愈椎間盤突出等疾病。所以髓核細胞相關科學研究及臨床試驗有著廣闊的空間。

[1]WOODS B L,VO N,SOWA G,et al.Gene therapy for intervertebral disk degeneration[J].Orthop Clin North Am,2011,42(4): 563-574.

[2]HOY D,MARCH L,BROOKS P,et al.Measuring the global burden of low back pain[J].Best Pract Res Clin Rheumatol, 2010,24(2):155-165.

[3]HOY D,BROOKS P,BLYTH F,et al.The Epidemiology of low back pain[J].Best Pract Res Clin Rheumatol,2010,24(6):769-781.

[4]BIBBY S R,JONES D A,LEE R B,et al.The pathophysiology of the intervertebral disc[J].Joint bone spine:revue du rhumatisme,2001,68(6):903-907.

[5]XIA X P,CHEN H L,CHENG H B.Prevalence of adjacent segment degeneration after spine surgery:a systematic review and Meta-analysis[J].Spine,2013,38(7):597-608.

[6]BECKER A,HELD H,REDAELLI M,et al.Implementation of a guideline for low back pain management in primary care:a cost-effectiveness analysis[J].Spine,2012,37(8):701-710.

[7]SMITH L J,CHIARO J A,NERURKAR N L,et al.Nucleus pulposus cells synthesize a functional extracellular matrix and respond to inflammatory cytokine challenge following long-term agarose culture[J].Eur Cell Mater,2011,22:291-301.

[8]O'HALLORAN D M,PANDIT A S.Tissue-engineering approach to regenerating the intervertebral disc[J].Tissue-engineering,2007, 13(8):1927-1954.

[9]李樹文,武海軍,銀和平,等.Ⅱ型膠原酶消化結合組織塊貼壁法分離培養兔髓核細胞[J].中國組織工程研究,2013,17(39):6861-6866.

[10]MEISEL H J,SIODLA V,GANEY T,et al.Clinical experience in cell-based therapeutics:disc chondrocyte transplantation A treatmentfordegeneratedordamagedintervertebraldisc[J]. Biomolecular Engineering,2007,24(1):5-21.

[11]WATANABE K,MOCHIDA J,NOMURA T,et al.Effect of reinsertion of activated nucleus pulposus on disc degeneration: an experimental study on various types of collagen in degenera tive discs[J].Connective Tissue Research,2003,44(44):104-108.

[12]FREEMONT A J.The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain[J].Rheumatology, 2009,48(1):5-10.

[13]IWASHINA T,MOCHIDA J,SAKAI D.Feasibility of using a human nucleus pulposus cell line as a cell source in cell transplantationtherapyforintervertebraldiscdegeneration[J]. Spine,2006,31(11):1177-1186.

[14]郭洪剛,馬信龍.組織工程學策略再生椎間盤的研究進展[J].中國矯形外科雜志,2009,17(1):37-39.

[15]KIM K W,CHUNG H N,HA K Y,et al.Senescence mechanisms of nucleus pulposus chondrocytes in human intervertebral discs[J].Spine Journal Official Journal of the North American Spine Society,2009,9(8):658-666.

[16]GRUBER H E,STASKY A A,HANLEY E N.Characterization and phenotypic stability of human disc cells in vitro[J].Matrix Biology,1997,16(5):285-288.

[17]KLUBA T,NIEMEYER T,GAISSMAIER C,et al.Human anulus fibrosis and nucleus pulposus cells of the intervertebral disc:effect of degeneration and culture system on cell phenotype[J].Spine,2005,30(24):2743-2748.

[18]韋葛堇,黃育強,覃萬安,等.髓核細胞共培養誘導骨髓間充質干細胞向類髓核細胞分化[J].中國組織工程研究,2013,17(45): 7834-7839.

[19]張燕,吳劍宏,王超鋒,等.非接觸式共培養體系對臍帶間充質干細胞向類髓核細胞的誘導分化效應[J].脊柱外科雜志,2011,9(4): 249-252.

[20]方煌,解禮偉,陳安民,等.脂肪間充質干細胞向髓核樣細胞誘導分化的初步研究[J].中國矯形外科雜志,2009,17(22):1729-1733.

[21]張榮峰,阮狄克,張超,等.不同代次成人正常髓核細胞的形態及生長動力學比較[J].脊柱外科雜志,2008,6(3):137-140.

[22]趙晨成,馬迅,張明,等.人骨髓間充質干細胞與髓核細胞共培養后的類髓核分化效應及其對髓核細胞表型的調節作用[J].中國現代醫生,2012,50(6):6-9.

（童穎丹 編輯）

Culture of human nucleus pulposus cellsin vitro and cryopreservation*

Peng-ju Xue1,Jun Ao2,Li-tao Zhao1,Ming-ke Guo1, Hai-wen Lyu1,Wen-hui Ji3,Huan-huan Huang4
(1.The First Department of Orthopedics,the Second Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan 471000,China;2.Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi,Guizhou 563003,China;3. Department of Anesthesiology;4.Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan 471000,China)

Objective To search for the best generation of the nucleus pulposus cells suitable as seed cells in tissue engineering,which come from the nucleus pulposus tissues of anterior cervical operation,and study the effects of cryopreservation and recovery process on typeⅡcollagen synthesis and proliferation of nucleus pulposus cells.Methods The mean optical density of the first,second,third,fourth and fifth generations of nucleus pulposus cells in immunohistochemical staining photographs was measured,so as to observe the difference between typeⅡcollagen content in cytoplasm.The primary nucleus pulposus cells were divided into groups A and B.The cells in the group A were frozen and the cells of the group B were not cryop－reserved.The proliferation activity of the nucleus pulposus cells in the group A and the group B was measured by MTT method and compared.The mean optical density values of immunohistochemical staining photos of the nucleus pulposus cells in the groups A and B were measured.Results Using enzyme digestion method, human nucleus pulposus cells were successfully extracted from the human nucleus pulposus tissues obtained from anterior cervical operation and cultured.The first and second generation cells were short fusiform,triangle or polygon.After the cells passaged to the third generation,they became spindle.The mean optical density of the first generation and the second generation of nucleus pulposus cells had no significant difference in the typeⅡcollagen immunohistochemical staining(P＞0.05).There was no obvious statistical difference in the mean optical density of typeⅡcollagen between the two groups(P＞0.05).There was no significant difference in optical density of MTT assay between the groups A and B(P＞0.05).Conclusions The cells of the human nucleus pulposus tissues obtained from anterior cervical operation could be culturedin vitroand passaged cells could be obtained.The first and the second generations of nucleus pulposus cells have little difference in the content of intracellular typeⅡcollagen and unobvious cell morphological differentiation,and could act as seed cells of nucleus pulposus tissue engineering.The cryopreservation and recovery processing could not reduce the content of typeⅡcollagen in the cytoplasm or cell proliferation.

nucleus pulposus cell;tissue engineering;seed cell;typeⅡcollagen

R681.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.011

1005-8982（2016）23-0053-06

2015-12-14

貴州省科技廳科學技術基金（No：黔科合J字20102179號）

敖俊，E-mail：ao00jun@163.com，Tel：13984989345