己烷體系中磷脂酶A1催化卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂的研究

楊國龍 楊若茜 畢艷蘭 孫尚德 陳競男

(河南工業大學 糧油食品學院，鄭州 450001)

己烷體系中磷脂酶A1催化卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂的研究

楊國龍 楊若茜 畢艷蘭 孫尚德 陳競男

(河南工業大學 糧油食品學院，鄭州 450001)

在己烷體系中，采用磷脂酶A1催化卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂。首先通過單因素試驗分別考察了加酶量、加水量、底物比、溫度和溶劑比對卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂的影響，并在此基礎上利用響應面法對反應工藝進行了優化。最終確定最佳工藝條件為：卵磷脂1.5 g，加酶量40 μL/g(磷脂酶A1/卵磷脂)，加水量25 μL/g(水/卵磷脂(PC))，底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)，溫度30 ℃，溶劑比：1∶2(PC/正己烷，W/V)，反應時間3.55 h，溶血磷脂轉化率達98.3%。結果表明，磷脂酶A1可以催化磷脂酰膽堿乙醇解反應制備溶血磷脂酰膽堿。

己烷 磷脂酶A1卵磷脂 乙醇解 溶血卵磷脂

磷脂作為一種脂蛋白載體普遍存在于動植物細胞中，對調節生物膜的生物活性和機體的代謝有重要功能[1]。磷脂還具有乳化、分散、起泡、降低黏度和保持水分等功能，是天然的離子型表面活性劑，在食品業、飼料業、化妝品和洗滌劑等領域都有應用[2]。但是未經改性的磷脂的HLB值(親水疏水平衡值)較低，在水相中不易分散，只能用做W/O型乳化劑，不適合做O/W型乳化劑，使用范圍被大大限制[3-4]。已有文獻報道，磷脂被改性后乳化穩定性、抗氧化性等都有很大提高[5]。溶血磷脂作為磷脂的改性產物既安全又高效，可應用于更加廣泛領域。

根據磷脂酶催化磷脂水解制備溶血磷脂的反應原理[1]，本試驗將羥基供體從水改為乙醇，選用專一作用于1-位酰基甘油鍵的磷脂酶A1，在己烷體系中催化大豆卵磷脂乙醇解制備溶血卵磷脂。

1 材料與方法

1.1 主要原料

大豆卵磷脂(PC≥98%)：沈陽天峰生物制藥有限公司；磷脂酶A1(Lecitase Ultra，10 KLU/g)：諾維信(中國)生物技術有限公司；三氯甲烷、甲醇：天津科密歐試劑有限公司。

1.2 主要儀器

DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；薄層棒狀色譜-火焰離子化檢測儀(IATROSCAN MK-6S)：三菱化學株式會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 磷脂酶A1催化卵磷脂醇解制備溶血卵磷脂

準確稱取1.5 g卵磷脂于50 mL圓底燒瓶中，加入適量的無水乙醇與正己烷(均用分子篩脫水)后放于調至一定溫度的恒溫磁力攪拌器中混合均勻，然后加入適量的水和磷脂酶A1開始反應。定時取樣分析產物中卵磷脂(PC)、溶血卵磷脂(LPC)、甘油磷脂酰膽堿(GPC)及其他物質含量，并計算LPC轉化率。

LPC轉化率=

1.3.2 原料卵磷脂及其醇解產物的組成分析

將樣品溶解于色譜純三氯甲烷中稀釋至適宜濃度，取1 μL溶液點于薄層色譜棒上，在展開液(CHCl3/CH3OH/H2O, 42/22/2.5,V/V/V)中展開后干燥5 min，然后利用火焰離子檢測器(FID)進行檢測分析[6]。

2 結果與討論

2.1 加酶量對溶血磷脂轉化率的影響

由圖1可得，當加酶量為40 μL時，由于加酶量較少，LPC轉化率隨反應時間的增加而緩慢增加，待5 h時反應結束后，LPC轉化率僅為39.7%。當加酶量為50 μL時，LPC轉化率的初始增長速率較加酶量為40 μL時明顯加快，在反應1.5 h時，LPC轉化率快速增至61.9%，而后增長速度明顯減緩，反應5 h結束后達到81.4%。當加酶量為60和70 μL時，LPC轉化率隨時間的增長趨勢基本一致，在反應0～1 h期間，LPC轉化率分別迅速增長至81.7%和83.5%，而后增長速度逐漸減小，在3 h后分別達到96.0%和95.5%，并維持平衡狀態。綜合試驗成本考慮，加酶量選擇60 μL效果好。

注：PC：1.5 g；加水量：40 μL/g(水/PC)；底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)；溫度：45 ℃；溶劑比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

圖1 加酶量對LPC轉化率的影響

2.2 加水量對溶血磷脂轉化率的影響

酶促反應的進行需要適量的水，研究表明，在疏水性溶劑體系中，酶表現最高活性所需的水要少于在親水性溶劑時所需要的量[7]。本試驗選用具有疏水性的正己烷為溶劑，雖然酶必需水的量有所降低，但過低的加水量會使酶分子的柔性變差，從而抑制酶的活性。反之，如果加水量過多，會造成過多水解副反應，同樣不利于試驗進行。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)；溫度：45 ℃；溶劑比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

圖2 加水量對LPC轉化率的影響

由圖2可得，當加水量為20 μL/g時，醇解反應進程緩慢，水分的不足嚴重抑制了磷脂酶的活性，反應5 h后，LPC轉化率僅為54.2%。當加水量為25 μL/g時，酶的活性較加水量為20 μL/g的情況有所改善，LPC轉化率初始增長速率明顯加快，待反應2 h后，LPC轉化率已增長至52.8%，隨后醇解反應進程明顯減緩，反應5 h結束后LPC轉化率較低，僅為70.4%。當加水量為30 μL/g時，一開始反應，LPC轉化率就迅速增加，僅僅2 h，就已經增長至79.4%，待反應5 h結束后增至90.9%，已處于平衡狀態。當加水量為35 μL/g時，LPC轉化率的初始增長速率較加水量為30 μL/g時更快，反應2 h時，LPC轉化率就已達到83.7%，反應5 h結束時，LPC轉化率進一步增長至94.9%，并且表現出持續增長的趨勢。

2.3 底物比對溶血磷脂轉化率的影響

由圖3可知，當底物比為1∶2時，由于乙醇含量較低，羥基供體不足，醇解反應無法充分進行，LPC轉化率的增長速度一直比較緩慢，在反應5 h結束時，僅為52.2%。但是，由于乙醇是種親水性有機溶劑，會奪取酶分子的必需水，從而抑制酶活性，因此如果乙醇含量較高，也會降低磷脂醇解率[8-9]。正如底物比為1∶4時顯示出的情況，雖然LPC轉化率較底物比為1∶2時有所增加，但是醇解反應仍不充分，待反應進行5 h結束時，LPC轉化率僅能達到76.9%。當底物比為1∶3時，乙醇含量較為適宜，LPC轉化率的增長情況較1∶2和1∶4時大大提高，僅反應3 h，轉化率已快速增至87.7%，并基本達到穩定狀態。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；加水量：30 μL/g(水/PC)；溫度：45 ℃；溶劑比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

圖3 底物比對LPC轉化率的影響

2.4 溫度對溶血磷脂轉化率的影響

由圖4可知，在反應溫度僅為30 ℃時，LPC轉化率在0～20 min呈現出近乎直線的增長形式，迅速達到60.3%，僅經過2 h，已達到了97.9%，并保持平衡。當反應溫度為35 ℃時，LPC轉化率的初始增長速率較溫度為30 ℃時更快，反應進行20 min時LPC轉化率為78.2%，隨后于反應1.5 h時增長至96.7%，并保持平衡狀態。Wang等[10]在水解大豆磷脂時對Lecitase Ultra進行了熱穩定性試驗，證明了水解磷脂時，磷脂酶A1是一種在較低溫度下就能表現較高酶活性的酶，這與本試驗所表現出來的情況基本一致。當反應溫度為40 ℃時，LPC轉化率的初始增長速率較溫度為30 ℃時有所減緩，反應進行20 min時LPC轉化率為50.7%，在反應3 h時增長至97.7%，并維持平衡狀態。雖然溫度越高，分子運動越劇烈，但當反應溫度升至45 ℃時，LPC轉化率的增長情況較30、35和40 ℃時已有明顯降低，反應5 h后，LPC轉化率才增長至90.9%，說明酶的分子結構已開始受到破壞。當反應溫度為50 ℃時酶活性已顯著下降，整個反應過程中LPC轉化率增長速度都十分緩慢，待5 h反應結束后，LPC轉化率只能達到31.0%。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；加水量：30 μL/g(水/PC)；底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)；溶劑比：1∶3(PC/正己烷，W/V)。

圖4 溫度對LPC轉化率的影響

2.5 溶劑比對溶血磷脂轉化率的影響

磷脂乙醇溶液黏度較大，為了提高磷脂的溶解性，本試驗選取正己烷為溶劑[11]。由圖5可得，當溶劑比為1∶1時，因體系中的傳質阻力大，LPC轉化率持續緩慢增長，反應5 h后僅增至44.9%。當溶劑比為1∶2時，體系中傳質阻力明顯減小，LPC轉化率初始增長速率顯著加快，在反應0.5 h后LPC轉化率迅速增加至67.4%，隨后增長速率趨于平緩，在反應2 h后達到98.0%，保持平衡狀態。當溶劑比為1∶3時，體系中傳質阻力進一步減小，LPC轉化率的初始增長速率較底物比為1∶2時更加迅速，在反應0.5 h后LPC轉化率達到78.0%，于2 h后增長至98.2%，也處于平衡狀態。溶劑越多，分子密度越小，分子碰撞概率降低，因此當溶劑比為1∶5和1∶10時LPC轉化率的初始增長速率均有所降低，LPC轉化率在反應0.5 h時分別為55.1%和33.5%，在3 h后達到平衡狀態并增至98.2%和98.4%。

注：PC：1.5 g；加酶量：60 μL；加水量：30 μL/g(水/PC)；底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)；30 ℃。

圖5 溶劑比對LPC轉化率的影響

2.6 響應面優化試驗

綜合考慮5個因素對試驗的影響，使用Design Expert 8.0軟件對LPC轉化率的優化選取四因素三水平的響應面設計，具體試驗方案和試驗結果如表1。

表1 試驗方案和結果

表2 方差分析結果

注：**：極顯著(P<0.001)；*：顯著(P<0.05)。

優化試驗結果及驗證如表3。由表3可知，理論值與實際值相差不大，說明利用響應面優化得到的工藝條件真實可靠，對實際生產具有一定指導作用。

圖6 因素間的交互作用對LPC轉化率的影響

加酶量/μL/g加水量/μL/g溫度/℃時間/h理論LPC轉化率/%實際LPC轉化率/%4025303.5599.4%(98.3±0.8)%

3 結論

對正己烷體系中磷脂酶A1(Lecitase Ultra)催化磷脂酰膽堿乙醇解制備溶血磷脂的反應條件進行了深入研究，然后利用響應面軟件建立了該反應的數學模型，并對模型進行了優化設計，得到最優工藝條件：卵磷脂1.5 g，加酶量/40 μL/g，加水量25 μL/g，底物比：1∶3(PC/無水乙醇，mol/mol)，溫度30 ℃，溶劑比：1∶2(PC/正己烷，W/V)，反應時間3.55 h，使得LPC轉化率可高達98.3%。結果表明，磷脂酶A1(Lecitase Ultra)可以催化磷脂酰膽堿乙醇解反應制備溶血磷脂酰膽堿。

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Preparation of the Lysophosphatidylcholine by Phospholipase A1-Catalyzed Ethanolysis of Soybean Phosphatidylcholine in Hexane

Yang Guolong Yang Ruoxi Bi Yanlan Sun Shangde Chen Jingnan

(Grain School,Henan University of Technology, Zhengzhou 450001)

Preparation of the lysophosphatidylcholine (LPC) applying ethanolysis of soybean phosphatidylcholine (PC) by phospholipase A1(Lecitase Ultra) in hexane has been studied in the paper. Effects of the reaction factors including phospholipase A1dosage, water content, substrate ratio, reaction temperature and solvent content on the LPC conversion of the phospholipase A1-catalyzed ethanolysis of soybean phosphatidylcholine have also been studied. Based on the single-factor experiments, the reaction conditions were optimized with Response Surface Method. The optimal conditions were as follows: PC of 1.5 g, phospholipase A1dosage of 40 uL/g (phospholipase A1/PC,V/W), water content of 25 uL/g (water/PC,V/W), substrate ratio of 1∶3 (PC/ethanol, mol/mol), solvent content of 1∶2 (PC/hexane,W/V), reaction temperature at 30 ℃, reaction time for 3.55 h. On these conditions, the convertion rate of LPC could be 98.3%. The results showed that the phospholipase A1(Lecitase Ultra) was able to catalyze ethanolysis of PC to prepare LPC.

hexane, phospholipase A1, phosphatidylcholine, ethanolysis, lysophosphatidylcholine

TS229

A

1003-0174(2016)03-0064-05

國家自然科學基金(31071558)，河南省高等學校青年骨干教師資助計劃(2011GGJS-079)

2014-07-24

楊國龍，男，1974年出生，副教授，脂質化學與生物技術