固定化α-淀粉酶制備麥胚蛋白工藝條件優(yōu)化

吳 定 謝慧慧 黃卉卉 路桂紅 劉長鵬 付懋林

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，南京 210046)

固定化α-淀粉酶制備麥胚蛋白工藝條件優(yōu)化

吳 定1謝慧慧1黃卉卉1路桂紅1劉長鵬1付懋林1

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，南京 210046)

固定化α-淀粉酶 麥胚蛋白質(zhì) 因子篩選 工藝優(yōu)化

小麥胚芽中蛋白質(zhì)含量高達(dá)31%～35%，分別是主糧大米、小麥粉的4.9倍和3.2倍[1]。麥胚蛋白質(zhì)的組成中，清蛋白占30.2%，球蛋白占18.9%，麥醇溶蛋白占14%，麥谷蛋白占0.3%～0.4%，水不溶性蛋白占30.2%[1-5]。

小麥胚芽蛋白(簡稱麥胚蛋白)是一種完全蛋白質(zhì)，含有20～23種氨基酸，而胚芽蛋白質(zhì)中人體健康需要的8種必需氨基酸占總氨基酸的35%，尤其是賴氨酸含量很高，比雞蛋高2倍，比大米、小麥粉高 6～7倍[1-10]。小麥胚芽蛋白中氨基酸模型與FAO/WHO頒布人體健康氨基酸建議模型相似[3-10]。

研究顯示，用游離α-淀粉酶水解麥胚蛋白提取液中淀粉，比非酶法可使蛋白質(zhì)含量和提取率分別提高15%和12%，蛋白質(zhì)純度達(dá)94%[11]。麥胚蛋白溶解度與pH值有關(guān)，在pH 4.0時溶解度最小，大于pH 6.0的液體中有很好的溶解度[3]。

固定化α-淀粉酶可以反復(fù)使用多次，從而降低游離酶只能使用一次的生產(chǎn)成本。同時，固定化α-淀粉酶酶促反應(yīng)控制比游離酶方便。

目前，用游離α-淀粉酶制備麥胚蛋白工藝已有報道[11]，而用固定化α-淀粉酶制備麥胚蛋白工藝鮮見報道。因此，為了開發(fā)小麥麥胚蛋白生產(chǎn)新工藝，進(jìn)行了固定化α-淀粉酶制備麥胚蛋白工藝條件的試驗優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

脫脂小麥胚芽試驗樣品、固定化α-淀粉酶：南京財經(jīng)大學(xué)發(fā)酵工藝實(shí)驗室[12-13]。

1.2 主要設(shè)備

TGL-16G型高速臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；THZ-22型恒溫振蕩機(jī)：上海世平實(shí)驗設(shè)備有限公司；FD-1B型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 麥胚蛋白質(zhì)含量測定(GB 5009.5—2010)

1.3.2 麥胚蛋白質(zhì)得率

蛋白質(zhì)得率=[(提取蛋白質(zhì)質(zhì)量×提取蛋白質(zhì)含量)/(麥胚粉質(zhì)量×麥胚粉蛋白質(zhì)含量)]×100%

1.3.3 麥胚蛋白提取工藝

脫脂小麥胚芽，經(jīng)過超微粉碎，過篩(100～200 目)后，稱取一定量脫脂麥胚粉，按照質(zhì)量/體積(g/L)比加入一定量鹽溶液(1∶4～1∶8)，在一定溫度(30～50 ℃)振蕩浸泡提取一定時間(40～60 min)，經(jīng)過離心(16 000 r/min)，收獲上層麥胚乳液。麥胚乳液，用酸調(diào)pH 5.0～7.0，加入固定化α-淀粉酶，置于一定溫度(55～65 ℃)水解一定時間(60～80 min)，取出固定化酶，酶水解液調(diào)pH值到4.0，經(jīng)過離心(16 000 r/min)，取沉淀用pH 7.0純凈水溶解，裝入透析袋于4～8 ℃透析，透析液經(jīng)過冷凍干燥得到麥胚蛋白質(zhì)。

1.3.4 Plackett-Burman試驗設(shè)計因子水平

Plackett-Burman(PB)設(shè)計，是一種從多因素中選取對試驗指標(biāo)有顯著影響因子的方法。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對小麥胚芽粉碎顆粒目數(shù)(以下簡稱麥胚目數(shù))、小麥胚芽粉質(zhì)量與浸提液體積比值(以下簡稱料液比)、浸提溫度、浸提時間、麥胚乳pH值、固定化酶水解麥胚乳液溫度(以下簡稱酶水解溫度)和固定化酶水解麥胚乳液時間(以下簡稱酶水解時間)進(jìn)行Plackett-Burman試驗設(shè)計，確定了PB設(shè)計每個因素的上、下限(表1)。

表1 影響水平試驗設(shè)計

利用Design expert7.1.3軟件，設(shè)計了7個影響因子PB試驗方案(表3)。按照設(shè)計的試驗序號和試驗水平參數(shù)進(jìn)行試驗。

1.3.5 響應(yīng)曲面優(yōu)化固定化酶制備麥胚蛋白工藝設(shè)計

通過PB設(shè)計，篩選出貢獻(xiàn)大的3個影響因子進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化水平組合試驗(表2)。

表2 響應(yīng)面分析因子水平表

采用design expert7.1.3軟件中Box-Behnken對因子1(料液比)、因子2(麥胚乳pH值)和因子3(酶水解溫度)進(jìn)行三因子三水平試驗設(shè)計，并依照試驗序號進(jìn)行試驗(表5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計及分析

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計方案和試驗結(jié)果

表4 試驗?zāi)Ｐ椭懈饔绊懸蜃臃讲罘治霰?/p>

注:***表示極顯著(P<0.001)；**表示顯著(P<0.05)；*表示不顯著(P>0.10)。

當(dāng)P值<0.05，說明該模型項影響顯著，試驗建立模型中B、E、F項的P值都小于0.05，其中E項(P=0.000 1)影響最大，其次是F項(P=0.000 5)和B項(P=0.0067)。當(dāng)P值>0.10，說明該模型項影響不顯著，而A、C、D、G項的P值都大于0.10，所以這些因子對模型影響貢獻(xiàn)均很小。因此，固定化酶制備麥胚蛋白的影響因子依次排序為：麥胚乳的pH值(E)>酶水解溫度(F)>料液比(B)。

2.2 固定化酶制備麥胚蛋白顯著影響因子的優(yōu)化

依據(jù) Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，采用蛋白質(zhì)得率作為試驗響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面分析試驗。Box-Behnken 試驗設(shè)計及其試驗結(jié)果見表5。

根據(jù)表5的試驗結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)面分析程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)得率進(jìn)行回歸分析，經(jīng)過回歸擬合得到蛋白質(zhì)得率(Y)與3個影響因子回歸方程：

Y=79.633 3+0.842 5X1+1.132 5X2-1.027 5X3-0.067 5X1X2-7.50E-003X1X3-0.622 5X2X3-0.302 9X12-2.177 9X22-1.892 9X32

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

表6 模型可信度分析統(tǒng)計結(jié)果

2.3 麥胚蛋白質(zhì)得率模型顯著性分析

通過 Design-expert 分析軟件，對回歸方程模型進(jìn)行方差分析(表7)。 模型具有高度的顯著性(F=19.98，P=0.002 1) ; 相對于純誤差來說，失擬(F=0.41)不顯著(表7)。因此，該模型可以用來試驗預(yù)測。

表7 回歸方程模型各項的方差分析

注:***表示極顯著(P<0.001)；**表示顯著(P<0.05)；*表示不顯著(P>0.10)。

若P值<0.05，說明影響因子有顯著影響；若P值>0.10，表明影響因子無顯著影響。3個影響因子對固定化酶制備麥胚蛋白質(zhì)工藝都有顯著影響，其影響力依次排序：麥胚乳pH值(X2)>酶水解溫度(X3)>料液比(X1)(表7)。3個因子中兩因子交互作用的無顯著影響。

對模型方程進(jìn)行逐步回歸，回歸方程存在穩(wěn)定編碼值(+0.92、+0.05、-0.28)，穩(wěn)定點(diǎn)的特征值表明為穩(wěn)定點(diǎn)的目標(biāo)點(diǎn)，即固定化酶制備麥胚蛋白優(yōu)化工藝參數(shù)：料液比為1∶7.84、麥胚乳pH值為5.025和酶水解溫度為58.6 ℃。在此條件下，麥胚蛋白質(zhì)得率的預(yù)測值為80.34%。考慮到應(yīng)用控制的方便性，將優(yōu)化工藝參數(shù)修訂為料液比為1∶7.8、麥胚乳pH值為5.0和酶水解溫度為58.5 ℃。

2.4 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

依據(jù)模型回歸方程，作響應(yīng)面曲面圖，考察了擬合響應(yīng)面的形狀，其響應(yīng)面曲線如圖1～圖3所示，反映了固定化酶制備麥胚蛋白質(zhì)工藝中3個主要影響因子對麥胚蛋白質(zhì)得率的影響。

圖1顯示，在酶解溫度60 ℃條件下，麥胚乳pH值和料液比對蛋白質(zhì)得率的影響。料液比一定水平時，麥胚乳pH值在-1～0水平范圍內(nèi)，隨著pH值增加，蛋白質(zhì)得率快速增加；在0～0.5水平范圍內(nèi)，隨著pH值增加，蛋白質(zhì)得率先緩慢增加，然后緩慢下降；在0.5～1水平范圍內(nèi)，隨著pH值增加，蛋白質(zhì)得率又開始較快下降。麥胚乳pH值一定水平時，料液比在-1～0.5水平范圍內(nèi)，隨著料液比增加，蛋白質(zhì)得率快速增加；在0.5～1的水平范圍內(nèi)，隨著料液比增加，蛋白質(zhì)得率增加緩慢。

圖2顯示，在麥胚乳pH 5.0條件下，酶水解溫度和料液比對蛋白質(zhì)得率的影響。料液比一定水平時，酶水解溫度在-1～0水平范圍內(nèi)，隨著酶水解溫度增加，蛋白質(zhì)得率直線增加；酶解溫度0水平時蛋白質(zhì)得率最高；在0～1水平范圍內(nèi)，隨著酶水解溫度增加，蛋白質(zhì)得率快速下降。酶水解溫度一定水平時，在料液比在-1～0.5水平范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，蛋白質(zhì)得率直線增加；在0.5～1水平范圍內(nèi)，隨著料液比得增加，蛋白質(zhì)得率緩慢增加。

圖3顯示，在料液比1∶6條件下，酶水解溫度和麥胚乳pH對蛋白質(zhì)得率影響。麥胚乳pH一定水平時，酶水解溫度在-1～0水平范圍內(nèi)，隨酶水解溫度增加，蛋白質(zhì)得率隨之增加，在酶解溫度0水平時，蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大值；在0～1的水平范圍內(nèi)，隨著酶解溫度增加，蛋白質(zhì)得率隨之下降。酶水解溫度一定水平時，麥胚乳pH值在-1～0水平單位內(nèi)，隨pH值得增加，蛋白質(zhì)得率快速直線增加；在0～0.5水平范圍內(nèi)，隨pH值增加，蛋白質(zhì)得率增加緩慢；在0.5～1水平范圍內(nèi)，隨pH增加，蛋白質(zhì)得率緩慢下降。

2.5 優(yōu)化工藝驗證試驗

按照修訂的優(yōu)化工藝參數(shù)，共進(jìn)行8批次樣本平行試驗，平均蛋白質(zhì)得率達(dá)到80.11%，與預(yù)測得率80.34%有很好吻合度。

3 結(jié)論

采用PB試驗及其影響因素方差分析，固定化酶制備麥胚蛋白的重要影響因子依次排序為：麥胚乳的pH值(E)>酶水解溫度(F)>料液比(B)。

采用麥胚乳的pH值、酶水解溫度和料液比進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，得到麥胚蛋白質(zhì)得率回歸方程：

通過方差分析顯示，麥胚乳的pH值、酶水解溫度和料液比對固定化酶制備麥胚蛋白工藝有顯著影響。

通過對模型回歸方程逐步回歸，得到固定化酶制備麥胚蛋白優(yōu)化工藝參數(shù)：料液比為1∶7.8、麥胚乳pH值為5.0和酶水解溫度為58.5 ℃。在此條件下，麥胚蛋白質(zhì)得率達(dá)到80.11%。

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Optimization of Preparation Process on Wheat Germ Protein by Immobilizedα-Amylase

Wu Ding1Xie Huihui1Huang Huihui1Lu Guihong1Liu Changpeng1Fu Maolin1

(School of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics1, Nanjing 210046)

immobilized α-amylase，wheat germ protein，factor screening，process optimization

TS210.9

A

1003-0174(2016)03-0115-05

江蘇省教育廳高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)(JHB04-003)

2014-08-04

吳定，男，1962年出生，教授，食品生物工程