萊茵衣藻IFT139蛋白抗原的原核表達、純化及多克隆抗體的制備

田 偉，董 彬，李鎮芳，孟德梅,，樊振川,

(1. 食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2. 天津科技大學新農村發展研究院，天津 300457)

萊茵衣藻IFT139蛋白抗原的原核表達、純化及多克隆抗體的制備

田 偉1，董 彬1，李鎮芳1，孟德梅1,2，樊振川1,2

(1. 食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2. 天津科技大學新農村發展研究院，天津 300457)

IFT139是萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)纖毛內運輸蛋白IFT復合物A中的一個重要組分．其編碼基因的突變、缺失或沉默將會影響纖毛正常的組裝和解聚，進而導致纖毛病的產生．為深入研究IFT139的作用機制，本實驗首先PCR獲得ift139 5′端458 bp的EST片斷，成功構建了pMAL-c2-ift139與pET-28a(＋)-ift139重組質粒．然后將重組質粒轉入大腸桿菌(E. coli)BL21(DE3)，通過IPTG誘導表達，分別得到相對分子質量為6.0×104和2.5×104的重組MBP/HIS-IFT139融合蛋白．進一步將親和純化的MBP-IFT139融合蛋白(純度95%,以上)，免疫新西蘭大白兔獲得抗血清，間接ELISA法測得血清效價為1∶256,000．最后將抗血清依次經Protein A和硝酸纖維素膜純化后，用Western blot檢測抗體特異性，結果顯示所制備抗體能夠正確特異性識別萊茵衣藻中的IFT139，從而為IFT139作用機制的闡明和纖毛相關疾病的研究奠定了重要基礎．

萊茵衣藻；纖毛；IFT139；表達純化；多克隆抗體

萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一種單細胞真核微藻，由一個直徑約為8,μm的細胞和兩根長度約為12,μm的纖毛組成．纖毛是一種細胞表面突起較為保守的細胞器，主要由細胞微管組成[1]．纖毛主要為萊茵衣藻提供動力使其運動，同時為其逃避敵害、尋覓食物等提供了便利．組裝纖毛所需要的蛋白均在萊茵衣藻細胞內合成，之后通過纖毛內運送蛋白(intraflagellar transport，IFT)運進纖毛，合成纖毛所需物質[2-3]．

IFT復合物由IFT-A和IFT-B兩個亞蛋白復合物組成[4]，復合物B負責從纖毛基體到頂端的順向運輸，依靠驅動蛋白-2(kinesin-2)；復合物A負責從頂端到基部的逆向運輸，利用的是細胞質動力蛋白(cytoplasmic dynein)[5-7]．順向運輸的過程中，IFT如同火車車廂般將合成纖毛所需要的蛋白組分運送到纖毛頂端，合成纖毛相關結構，進行纖毛的組裝．逆向過程是將解聚的纖毛組分或周轉蛋白運出纖毛，從而完成一個循環過程[8-10]．萊茵衣藻作為一種典型的模式生物，與人類細胞的纖毛非常相近，所以，IFT139抗體的制備不僅可用于研究衣藻纖毛的相關功能，也可用于研究人體內纖毛的結構及功能．多項研究表明，纖毛中基因的突變或缺失，會造成纖毛生成缺陷，從而導致纖毛相關疾病的產生[11-14]．

IFT139作為一種纖毛內運輸蛋白，是IFT-A復合物中的重要組分．目前已有研究表明人類纖毛基因ift139的純合錯義突變會導致局灶節段性腎小球疾病，造成腎小球基膜增厚，腎小管萎縮，顆粒物質的積累等癥狀[15-16]，然而對于IFT139作用機制目前仍沒有清晰的認識．本研究對于IFT139在大腸桿菌中的表達、純化及其多克隆抗體的制備，對于今后研究IFT139在纖毛中的作用及IFT139與其他蛋白復合物的相互作用提供了理論基礎，也對于纖毛病的診斷提供了有利的方法基礎．

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒及實驗動物

大腸桿菌(E. coli)XL1-blue與BL21(DE3)菌株，pMAL-c2-acbp與 pET-28a(+)-acbp質粒均是本實驗室保存；pBlu-ift139由中科院水生所黃開耀老師實驗室所贈；實驗動物為雄性新西蘭大白兔，購自天津歐陽實驗種兔公司．

1.2 主要試劑

質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA產物純化試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG和胰蛋白胨，北京索萊寶生物科技有限公司；限制性內切酶、T4,DNA連接酶、pfu DNA聚合酶和蛋白Marker，加拿大Fermentas公司；DNA Marker，北京全式金生物技術有限公司；親和層析填料，GE公司；AP(堿性磷酸酶)標記的羊抗兔抗體IgG和TMB (3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺)底物顯色試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司；弗氏完全和不完全佐劑，美國Sigma公司；其他常用試劑均為國產分析純．

1.3 PCR擴增ift39基因

位于pBlu-ift139載體上的目的基因ift139，是屬于全基因序列5′端458,bp的EST片段，根據NCBI中萊茵衣藻ift139的基因序列及原核表達載體圖譜，進行PCR引物設計．上游引物加入BamHⅠ酶切位點：5′-ATGGATCCATGGCGGACAGGGTACTT-3′，下游引物加入HindⅢ酶切位點：5′-ATAAGCTTCTG ATGATGATCCAGCCCA-3′，加粗斜體部分即為引入的酶切序列，引物設計后送往北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成．利用含ift139基因的重組質粒pBluift139為模板，50,μL的反應體系進行PCR擴增，反應條件為：95,℃ 1,min；95,℃ 30,s、57,℃ 30,s、72,℃40,s，30個循環；72,℃ 10,min．取2,μL PCR產物進行0.8%,的瓊脂糖凝膠電泳分析[17-18]．

1.4 重組質粒的構建

將PCR產物和實驗室現存質粒pMAL-c2-acbp、pET-28a(+)-acbp使用BamHⅠ和HindⅢ于37,℃雙酶切3,h，回收目的片段和對應載體，然后分別將獲得黏性末端的PCR產物和載體在T4,DNA 連接酶的作用下重組質粒，4,℃連接過夜，轉化．分別在對應抗生素的培養基平板上篩選單克隆，提取重組質粒并雙酶切驗證，質粒測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成[19-20]．

1.5 融合蛋白的表達與純化

1.5.1 融合蛋白的表達

采用CaCl2轉化法將重組質粒pMAL-c2-ift139、pET-28a(+)-ift139轉入BL21，在對應抗生素的平板上挑取單克隆，37,℃過夜搖菌培養，次日以1∶20稀釋繼續培養，待1,h后進行A600的測定．A600＝0.6～0.8時，28,℃、0.2,mmol/L的IPTG誘導表達6,h，于4,℃、3,900,r/min離心10,min，收集菌體，PBS洗滌3次后，置于冰上超聲破碎1,h．最后將破碎后的全蛋白、離心得到的上清液、用PBS處理后的沉淀按照一定的順序等量上樣，采用SDS-PAGE電泳分析融合蛋白表達情況[21-23]．

1.5.2 MBP-IFT139融合蛋白的純化

將pMAL-c2-ift139擴大培養獲得大量菌液，經超聲破碎，12,000,r/min離心10,min得到上清液，與MBP凝膠過夜結合，未結合的液體流出．然后用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.5)清洗雜蛋白3次，最后用含10%,麥芽糖的洗脫液將目標蛋白從直鏈淀粉樹脂上競爭性地洗脫下來．取樣進行SDS-PAGE電泳分析蛋白純度[24]．

1.5.3 HIS-IFT139融合蛋白的純化

將pET-28a(+)-ift139擴大培養獲得大量菌液，經超聲破碎，12,000,r/min離心10,min得到沉淀．用含20,mmol/L咪唑的漂洗緩沖液(含1,mol/L尿素)洗滌沉淀3次，用結合緩沖液(含8,mol/L尿素)將沉淀溶解3,h后，于4,℃、12,000,r/min離心10,min取上清液．然后與Ni柱凝膠過夜結合，流出液體后，分別用含20、40、80,mmol/L咪唑的漂洗緩沖液(含8,mol/L尿素)清洗雜蛋白3次，用含500,mmol/L咪唑的洗脫緩沖液(含8,mol/L尿素)洗脫目的蛋白，取樣進行SDS-PAGE電泳分析蛋白純度[25]．

1.6 多克隆抗體的制備及效價的測定

1.6.1 抗血清的制備

實驗動物是3月齡、體質量在1.5～2,kg的雄性新西蘭大白兔，喂養1周后進行第1次免疫，取1,mol/L抗原1,mL與同劑量的弗式完全佐劑進行充分乳化后，采用背部皮下多點注射，初次免疫之前取血作為后續實驗的陰性對照．之后每隔10～14,d進行第2～5次加強免疫，使用弗氏不完全佐劑，最后以心臟穿刺的方法獲得全血，將血液室溫靜置1,h或4,℃靜置過夜，于4,℃、3,000,r/min離心10,min，清澈透明的上清液即為抗血清，如有紅色溶血進入，可再次離心取上清液，然后于-80,℃分裝保存[26-27]．

1.6.2 抗血清效價的測定

采用間接ELISA法測定效價．將經包被液稀釋的抗原MBP-IFT39包被于酶標板上，每孔1,μg，4,℃包被過夜；加入0.5%,脫脂乳粉37,℃封閉1,h；加入經PBS溶液(pH 7.5)梯度稀釋的兔血清，37,℃孵育1,h；加入經PBS溶液(pH 7.5)稀釋20,000倍的HRP標記的羊抗兔二抗，37,℃孵育30,min；加入TMB顯色液，室溫避光顯色25～30,min；最后加入0.5,mol/L H2SO4終止液，終止反應，在450,nm 波長下用酶標儀測定吸光度[28-29]．

1.7 多克隆抗體的純化及特異性分析

1.7.1 Protein A純化抗體

將填料(Protein A Sepharose)與親和層析柱按照其說明分別進行前處理后，加入經Binding Buffer稀釋的抗血清(1,mL抗血清＋1,mL Binding Buffer)，充分結合，用Binding Buffer沖洗層析柱，約1,h后雜蛋白峰趨于水平狀態，加入0.1,mol/L、pH 2.7的甘氨酸洗脫液進行洗脫，收集抗體，為了保證酸不穩定的IgG，添加1,mol/L、pH 9.0的Tris-HCl以中和洗脫下來的抗體，使pH 為7.0．將抗體于-20,℃暫時保存以備下一步純化[30-31]．

1.7.2 膜純化抗體

取2,mg另一標簽的融合蛋白HIS-IFT139進行SDS-PAGE蛋白電泳；電泳結束后，凝膠轉移至NC膜上；將膜進行麗春紅染色10,min，剪下目的條帶，用TBST溶液(100,mL 10× TBS溶液，895,mL去離子水，5,mL 10%,的吐溫20)洗膜3次，至膜上的顏色全部褪去；加入3,mL的5%,的脫脂乳粉室溫封閉1,h；加入上步純化的抗體(≥3,mg)進行孵育，4,℃搖床過夜；用TBST溶液洗膜3次后加入0.1,mol/L、pH 2.7的甘氨酸洗脫液進行洗脫，收集抗體．測定濃度后加入甘油至體積分數為30%,于-20,℃短期保存，-80,℃長期保存再加入疊氮化鈉至終質量濃度為0.3,g/L[32]．

1.7.3 抗體特異性檢測

采用蛋白免疫印跡(Western blot)方法．將微藻樣品CW92經過處理后[33]進行SDS-PAGE蛋白電泳，轉至NC膜上，加入5%,的脫脂乳粉進行室溫封閉1,h后，分別以1∶100和1∶500的稀釋比例加入純化后的抗體作為一抗，室溫孵育1,h，以1∶2,500的稀釋比例加入AP標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1,h，最后加入顯色液進行顯色，凝膠成像儀觀察[34]．

2 結果與分析

2.1 重組質粒載體的鑒定

以質粒pBlu-ift139為模板進行PCR，獲得約為458,bp的基因片段，與預期大小相符合，如圖1(a)所示；重組質粒pMAL-c2-ift139、pET-28a(+)-ift139經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切之后，分別得到對應的載體和458,bp的片段，與目的基因大小相一致(圖1(b)、(c))；重組質粒的測序結果經比對后與NCBI中ift139基因序列一致，證明重組質粒構建成功．

2.2 融合蛋白的表達與純化

2.2.1 融合蛋白的表達

pMAL-c2-ift139經IPTG誘導表達的重組蛋白MBP-IFT139，相對分子質量約為6.0×104，與預期相符(圖2)，溶于上清液．

圖1 ift139的PCR擴增及重組質粒的雙酶切驗證Fig. 1 PCR amplification of ift139 and identification of recombined plasmids with double restriction enzyme digestion

pET-28a(+)-ift139經IPTG誘導表達的重組蛋白HIS-IFT139，相對分子質量約為2.0×104，與預期相符(圖3)，以包涵體的形式存在．

圖2 SDS-PAGE檢測重組表達載體pMAL-c2-ift139在E．coli BL21(DE3)中的表達Fig. 2SDS-PAGE analysis of the expression of recombined vector pMAL-c2-ift139 in E．coli BL21(DE3)

圖3 SDS-PAGE檢測重組表達載體pET-28a(+)-ift139在E．coli BL21(DE3)中的表達Fig. 3SDS-PAGE analysis of the expression of recombined vector pET-28a(+)-ift139 in E．coli BL21 (DE3)

2.2.2 融合蛋白的純化

MBP-IFT139和HIS-IFT139融合蛋白的親和純化結果如圖4所示．

圖4 MBP-IFT139和HIS-IFT139融合蛋白的親和純化Fig. 4Affinity purification of MBP-IFT139 and HISIFT139

MBP-IFT139與HIS-IFT139融合蛋白分別經MBP和HIS親和層析柱純化后得到相對分子質量約為6.0×104、2.0×104的目標條帶，分子質量大小均與預期相符，對應質量濃度分別為1.3、1.1,mg/ mL．MBP-IFT139蛋白純度達95%,以上，可作為抗原進行免疫兔子，HIS-IFT139上面有些雜帶，但是不影響切膜純化抗體．

2.3 多克隆抗體的制備

2.3.1 抗血清效價的測定

用純化得到的MBP-IFT139融合蛋白免疫新西蘭大白兔，經過5次免疫之后，在耳緣靜脈少量采血，利用間接ELISA法測定抗血清的效價如圖5所示，免疫抗血清A450與陰性對照血清A450之比大于等于2.1，即為陽性．所以，可得最高稀釋倍數1∶256,000為抗血清的效價．

圖5 抗血清效價的ELISA法測定Fig. 5 Determination of the antiserum titer with ELISA method

2.3.2 抗體的特異性分析

經Protein A純化得到的IgG抗體，經Western blot初步檢測分析發現抗體的特異性較差，又經過硝酸纖維素膜純化法對抗體進一步純化，得到的抗體由Western blot檢測分析，結果如圖6所示．

不同稀釋倍數的抗體均可與微藻中的IFT139蛋白(相對分子質量約為1.40×105)特異性結合，形成明顯的單一條帶且大小與預期相符合．這表明多克隆抗體成功制備．

圖6 Western blot 檢測IFT139抗體的特異性Fig. 6 Specificity analysis of IFT139 polyclonal antibody with Western blot

3 討 論

纖毛不僅是萊茵衣藻重要的組成部分，還分布于哺乳動物的多個器官和組織中，調控著動物的生長及發育．纖毛內基因的突變或蛋白缺失都將會對動物的生長及生理造成一定的影響，從而導致各種纖毛相關疾病的出現．像與纖毛運動功能相關的疾病：原生纖毛不動綜合征、呼吸道感染、生殖功能降低、輸卵管異常、內臟移位等[13]；與纖毛感覺功能相關的疾病：視覺系統異常造成的視力下降或完全失明、聽覺系統中纖毛的結構變化導致聽力下降或失聰、嗅覺不靈敏等[14]；與信號傳導功能有關的疾病：巴德畢氏綜合癥(BBS)，像多指癥、肥胖癥、視力下降、精神呆滯等[35-37]．

本研究中ift139基因的突變、沉默等都將會對IFT139蛋白的合成造成一定的影響，繼而可能會造成纖毛的組裝缺陷，最終導致腎消耗病和窒息性胸營養不良綜合癥等疾病[15-16]．在IFT-B如IFT80、IFT46等蛋白進行免疫共沉淀等實驗研究中，IFT139常作為IFT-A中的重要組分被對比使用．然而，對于IFT139的研究還有很多未知和值得探討的東西，它在纖毛中具體有哪些作用、其編碼基因的突變或缺失會導致哪些疾病等內容均不清晰．本實驗從PCR擴增目的基因ift139開始，成功構建了兩種原核表達載體，通過IPTG的誘導表達得到重組蛋白，并進一步純化抗原并免疫動物得到高效價的抗血清，然后經過抗體的兩步純化及特異性分析驗證，成功獲得了抗MBP-IFT139融合蛋白的多克隆抗體，對于今后研究IFT139在纖毛中的作用及IFT139與其他蛋白復合物共同作用提供了研究基礎，也對纖毛病的進一步深層次研究提供了有利支持．

［1］ Cole D G. Intraflagellar transport in the unicellular green alga，Chlamydomonas reinhardtii[J]. Protist，2003，154(2)：181-191.

［2］ 謝傳曉，韓偉，余增亮. 模式生物衣藻及其研究進展[J]. 遺傳，2003，25(3)：350-354.

［3］ Scholey J M. Intraflagellar transport[J]. Annual Review of Cell and Developmental Biology，2003，19：423-443.

［4］ Williamson S M，Silva D A，Richey E，et al. Probing the role of IFT particle complex A and B in flagellar entry and exit of IFT-dynein in Chlamydomonas[J]. Proto-plasma，2012，249(3)：851-856.

［5］ Lechtreck K F，Luro S，Awata J，et al. HA-tagging of putative flagellar proteins in Chlamydomonas reinhardtii identifies a novel protein of intraflagellar transport complex B[J]. Cell Motility and the Cytoskeleton，2009，66(8)：469-482.

［6］ Awan A，Bernstein M，Hamasaki T，et al. Cloning and characterization of Kin5，a novel Tetrahymena ciliary kinesinⅡ[J]. Cell Motility and the Cytoskeleton，2004，58(1)：1-9.

［7］ Pan J，Snell W J. Kinesin II and regulated intraflagellar transport of Chlamydomonas aurora protein kinase[J]. Journal of Cell Science，2003，116(11)：2179-2186.

［8］ Wood C R，Wang Z，Diener D，et al. IFT proteins accumulate during cell division and localize to the cleavage furrow in Chlamydomonas[J]. PLoS One，2012，7(2)：e30729．

［9］ Wang Z，Fan Z C，Williamson S M，et al. Intraflagellar transport(IFT)protein IFT25 is a phosphoprotein component of IFT complex B and physically interacts with IFT27 in Chlamydomonas[J]. PLoS One，2009，4(5)：e5384.

［10］ Cole D G. The intraflagellar transport machinery of Chlamydomonas reinhardtii[J]. Traffic，2003，4(7)：435-442.

［11］ Iomini C，Li L，Esparza J M，et al. Retrograde intraflagellar transport mutants identify complex A proteins with multiple genetic interactions in Chlamydomonas reinhardtii[J]. Genetics，2009，183(3)：885-896.

［12］ Gerdes J M，Davis E E，Katsanis N. The vertebrate primary cilium in development，homeostasis，and disease [J]. Cell，2009，137(1)：32-45.

［13］ 曹木青，潘俊敏. 纖毛及纖毛相關疾病研究進展[J].中國細胞生物學學報，2012，34(9)：849-856.

［14］ 潘俊敏. 衣藻纖毛與纖毛相關疾病[J]. 中國科學，2008，38(5)：399-409.

［15］ Huynh Cong E，Bizet A A，Boyer O，et al. A homozygous missense mutation in the ciliary gene TTC21B causes familial FSGS[J]. Journal of the American Society of Nephrology，2014，25(11)：2435-2443.

［16］ Davis E E，Zhang Q，Liu Q，et al. TTC21B contributes both causal and modifying alleles across the ciliopathy spectrum[J]. Nature Genetics，2011，43(3)：189-196.

［17］ 陳春琳，劉祥，俱雄. 溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的原核表達及多克隆抗體制備[J]. 西北農林科技大學學報，2015，43(7)：1-8.

［18］ 羊揚，厚華艷，郁磊，等. 大腸桿菌 K99 菌毛 fan 操縱子的克隆、表達及活性[J]. 微生物學報，2012，52(12)：1524-1530.

［19］ 向斌，周智廣，黃干. 人羧基肽酶H原核表達載體的構建及其應用[J]. 中國糖尿病雜志，2007，15(2)：84-86.

［20］ 李驊，胡嘉，李艷君，等. 人LC3蛋白在大腸桿菌中的表達純化及其抗體的制備與鑒定[J]. 細胞與分子免疫學雜志，2012，28(5)：517-519.

［21］ 徐秋芳，陳倪. 灰飛虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表達及多克隆抗體制備[J]. 中國農業科學，2014，47(19)：3791-3798.

［22］ Wu Z，Wang W，Li Y，et al. Development of polyclonal antibodies against nucleocapsid protein of watermelon silver mottle virus and their application to diagnostic[J]. Acta Virologica，2014，58(2)：167-172.

［23］ Liu F，Wu X，Li L，et al. Expression，purification and characterization of two truncated peste des petits ruminants virus matrix proteins in Escherichia coli，and production of polyclonal antibodies against this protein[J]. Protein Expression and Purification，2013，91(1)：1-9.

［24］ Duplay P，Hofnung M. Two regions of mature periplasmic maltose-binding protein of Escherichia coli involved in secretion[J]. Journal of Bacteriology，1988，170(10)：4445-4450.

［25］ Li Y，Wang J，Yang J，et al. Recombinant expression，purification and characterization of antimicrobial peptide ORBK in Escherichia coli[J]. Protein Expression and Purification，2014，95(5)：182-187.

［26］ 查宏賢，劉罡，張晨，等. 家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑4(serpin-4)的基因克隆、原核表達和多克隆抗體制備[J]. 昆蟲學報，2011，54(6)：642-647.

［27］ Kapoor R，Mandal B，Paul P K，et al. Production of cocktail of polyclonal antibodies using bacterial expressed recombinant protein for multiple virus detection [J]. Journal of Virological Methods，2014，196(2)：7-14.

［28］ Jiang W，Liu X，Wu D，et al. A simple，rapid one-step ELISA using antibody-antibody complex[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry，2015，62(1)：126-131.

［29］ Limsuwanchote S，Wungsintaweekul J，Yusakul G，et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1，a distinctive saponin from Panax notoginseng，and its application to indirect competitive ELISA [J]. Planta Medica，2014，80(4)：337-342.

［30］ 張明娟，張美程，朱參戰，等. 抗鈉泵α,2亞單位截斷性片段多肽抗體的制備與鑒定[J]. 南方醫科大學學報，2015，35(2)：168-173.

［31］ Reusch D，Haberger M，Selman M H，et al. Highthroughput work flow for IgG Fc-glycosylation analysis of biotechnological samples[J]. Analytical Biochemistry，2013，432(2)：82-89.

［32］ 駱愛玲，梁崢. 用硝酸纖維素膜親和法純化抗體[J].植物學報，1997，39(6)：534-536.

［33］ Pazour G J，Wilkerson C G，Witman G B. A dynein light chain is essential for the retrograde particle movement of intraflagellar transport(IFT)[J]. Journal of Cell Biology，1998，141(4)：979-992.

［34］ Sun J，Tu M，Han B，et al. Generation and characterization of rabbit polyclonal antibodies against Vasohibin-2 for determination of its intracellular localization[J]. International Journal of Oncology，2013，43(1)：255-261.

［35］ Pazour G J，Rosenbaum J L. Intraflagellar transport and cilia-dependent diseases[J]. Trends in Cell Biology，2002，12(12)：551-555.

［36］ Bisgrove B W，Yost H J. The roles of cilia in developmental disorders and disease[J]. Development，2006，133(21)：4131-4143.

［37］ 柳林，紀偉. 纖毛疾病和與之相關的基因[J]. 現代生物醫學進展，2012，12(2)：373-376.

責任編輯：郎婧

Prokaryotic Expression，Purification and Polyclonal Antibody Preparation of Chlamydomonas reinhardtii IFT139 Protein Antigen

TIAN Wei1，DONG Bin1，LI Zhenfang1，MENG Demei1,2，FAN Zhenchuan1,2
(1．Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2．Institute for New Rural Development ，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

IFT139 is a key component of the intraflagellar transport(IFT)complex A in Chlamydomonas reinhardtii．Mutations，deletions or silence of ift139 gene can affect cilia assembly and depolymerization，and thus lead to ciliopathy．To further investigate the role of IFT139 in ciliogenesis，ift139 5′-458 bp EST cDNA fragment was firstly amplified and the recombined plasmids pMAL-c2-ift139 and pET-28a(＋)-ift139 were constructed and transferred into Escherichia coli BL21(DE3)．Under IPTG induction，fusion proteins MBP-IFT139 and HIS-IFT139 with a molecular weight of 6.0×104and 2.5×104，respectively，were obtained．The fusion protein MBP-IFT139 was purified by affinity adsorption purification(more than 95%, purity)and then used for immunizing New Zealand white rabbits to produce antiserum．When the titer of antiserum reached 256,000，it was purified by Protein A，and then affinity adsorption purification was followed by nitrocellulose membrane purification procedure．The specificity of polyclonal antibodies was evaluated with Western blot．The result showed that the polyclonal antibody can specifically recognize IFT139．The research has provided an important tool for further clarifying the role of IFT139 in ciliogenesis and cilipathy.

Chlamydomonas reinhardtii；cilia；IFT139；expression and purification；polyclonal antibody

Q786

A

1672-6510(2016)06-0027-07

10.13364/j.issn.1672-6510.20160029

2016-01-24；

2016-04-14

國際遺傳工程與生物技術中心(ICGEB)研究資助項目(CRP/CHN15-01)

田 偉（1989—），女，山東人，碩士研究生；

樊振川，教授，fanzhen@tust.edu.cn.