孤兒肽在肺動脈高壓大鼠中的表達

張洪亮,賈阿娜,劉春輝,王 慧,范 蕾,趙智敏,賀兆發

(1.佳木斯大學附屬第一醫院心內科，黑龍江 佳木斯 154003；2. 佳木斯市急救中心，黑龍江 佳木斯 154002)

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孤兒肽在肺動脈高壓大鼠中的表達

張洪亮1,賈阿娜2,劉春輝1,王 慧1,范 蕾1,趙智敏1,賀兆發1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院心內科，黑龍江 佳木斯 154003；2. 佳木斯市急救中心，黑龍江 佳木斯 154002)

目的:探討孤兒肽( orphanin FQ, OFQ)在肺動脈高壓大鼠肺動脈組織及血漿中表達水平變化意義。方法:20只雄性SD大鼠隨機分為肺動脈高壓誘導組(n=15)和對照組(n=5)，肺動脈高壓誘導組采用腹腔注射野百合堿( monocrotaline，MCT) 60mg/kg體重，對照組腹腔注射等體積的0.9%生理鹽水。在注射野百合堿7、14、21、28d后，檢測大鼠肺組織中mRNA的表達情況，并應用免疫組織化學技術定位OFQ在肺動脈組織中表達。結果:OFQ在肺動脈高壓大鼠肺組織中表達隨時間增加呈現正相關，同時在血漿中OFQ表達變化隨著肺動脈高壓進展而增加，OFQ表達變化與肺動脈血液動力學指標及右心室肥厚指數呈現明顯相關性，免疫組化顯示OFQ定位于肺小動脈的內皮細胞及平滑肌細胞。結論:OFQ在野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠血漿及肺動脈中表達升高，它可以作為判定肺動脈高壓嚴重程度的重要指標，可能參與肺動脈高壓發病血管重塑機制。

肺動脈高壓；孤兒肽；大鼠；野百合堿

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一類以肺動脈壓力和肺小血管阻力進行性增加為特征的臨床病理綜合征，往往伴有右心衰竭，肺血栓形成及血液動力學變化，嚴重者會危及生命[1]。肺小動脈血管重構是其主要病理改變，重構的主要表現為：肺動脈血管內皮細胞及平滑肌細胞過度增殖，一些無肌小動脈出現肌層樣改變，同時伴有肺組織纖維化、炎癥浸潤及血栓形成。

孤兒肽( orphanin FQ, OFQ )或稱痛敏肽( nociceptin ) ,是一類與阿片肽具有高度同源的肽類物質，OFQ最早從大鼠和豬的腦組織中分離得到的一種新的17肽，實驗證明孤兒肽為阿片樣受體的內源性配體[2]。OFQ前體在中樞神經系統組織中具有廣泛的表達，近年來發現在其他器官如腎臟、脾以及生殖系統中存在表達。McDonald 研究發現OFQ主要表達于冠狀動脈粥樣硬化的動脈組織，同時在發生心力衰竭時候也有表達，但心肌組織中沒有明顯的表達[3]。

目前關于OFQ在肺動脈高壓中的表達情況尚無報道，本研究對MCT誘導的PAH大鼠肺動脈及血漿中OFQ變化進行探究，進一步觀察PAH肺組織及肺動脈中是否具有OFQ分布，并為OFQ參與血管重構及血管效應機制研究提供初步參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

MCT(Sigma公司)，TRIZOL(Takara公司)，大鼠OFQ酶聯免疫吸附試驗( enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 檢測試劑盒(Linco公司)，PCR引物(Invitrogen 公司), AMV 逆轉錄試劑盒 (Promega 公司), Power SYBR green PCR master mix (ABI 公司)， Anti-Nociceptin抗體(ab100880)。

1.2 肺動脈高壓動物模型制備及樣本采集

健康SD大鼠20只，雄性，體重260～300g(8周齡)，被隨機分成正常對照組(control 組n=5)和秋水仙堿誘導組(MCT組n=15)，MCT組采用2% MCT以60mg/kg劑量SD大鼠一次性腹腔注射， control組采用等量生理鹽水SD大鼠腹腔注射，正常飼養4w。在注射MCT后分別于7、14、21、28d進行血液動力學監測(右心導管法)，檢測指標包括：右室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓，測量評估右心室肥厚指數，評估肺動脈高壓嚴重程度。收取實驗大鼠血漿標本，分裝后凍存于-80℃冰箱，留取肺組織迅速凍存于液氮之中備用。

1.3 免疫組化染色實驗

肺組織應用福爾馬林固定后石蠟包埋制成蠟塊，切片，貼片后以PBS清洗3遍，每次5min，進行高壓修復；Triton X-100孵育20min，滴加封閉液，37℃ 封閉30min，加入Anti-Nociceptin抗體(ab100880)(1:200)，4℃過夜，PBS洗3次，每次5min，加入辣根過氧化物酶標記二抗(1∶500) ，室溫孵育2h;PBS 洗3 次，每次5min，加入ABC復合物，室溫孵育2h;PBS洗3次，每次5min，用蒸餾水迅速沖3 次; DAB 顯色，PBS終止顯色。梯度酒精進行脫水，封片后拍照。

1.4 OFQ在肺組織mRNA表達檢測

實時熒光定量聚合酶鏈式反應( real time PCR，RT-PCR)取凍存肺組織約100mg，應用Trizol法提取總RNA，應用NanoDrop 2000進行RNA定量，各組RNA樣品的A260 /A280nm吸光度比值均在1.8～2.0之間。將2μg 的總RNA反轉錄成相應的cDNA。根據據已發表文獻的OFQ前體cDNA核甘酸序列引物序列[4]，由Invitrogen公司合成引物如下: 正義鏈引物(sense primer)為: 5′-T GGATCCCACGGCTGCACCATGAA-3′，反義鏈引物( anti sense primer)為: 5′-GAATTCGGCTCCTTCTGGCT ACACATTAC-3'；內參為GAPDH: 正義鏈引物5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'，反義鏈引物5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'。RT-PCR反應條件：反應條件是：95℃ 30s預變性，95℃ 10s變性和60℃ 30s退火及延伸，進行40個循環。每個PCR反應進行三個重復，使用ABI Real-time PCR儀(Applied Biosystems)運行程序，結果使用2(-ΔΔCT)計算方法進行數據分析。

1.5 ELISA法檢測大鼠血漿中OFQ濃度

MCT誘導大鼠肺動脈高壓血漿OFQ濃度使用Linco公司的試劑盒，按照說明書中操作步驟進行，試驗重復3次。及具體方法：用包被緩沖液將抗體稀釋后加入96孔板4℃過夜，次日棄掉孔內溶液，應用TBST沖洗后加入樣品100μL，37℃孵育1h，各反應孔中加入新鮮稀釋的酶標抗體100μL,37℃孵育1h，洗滌。底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100μL，37℃30min，于各反應孔中加入2M硫酸50μL終止反應。

1.6 統計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，連續變量應用平均數±標準差表示，one-way ANOVA 來進行方差分析及顯著性檢驗，以P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 OFQ的mRNA在MCT誘導肺動脈高壓大鼠肺組織RT-PCR的表達

MCT誘導肺動脈高壓大鼠肺組織中OFQ mRNA表達變化，應用RT-PCR檢測MCT誘導肺動脈高壓大鼠肺組織中OFQ mRNA表達情況，與control組比較結果顯示：MCT誘導PAH組在14d出現OFQ表達升高，時間的增加呈現逐步升高。分析結果顯示：在14天時候OFQ的表達量(fold change)為control組的2.9倍，28d則達到3.7倍。見圖1。

圖1 OFQ在MCT誘導肺動脈高壓大鼠肺組織中的表達

2.2 HE染色光鏡觀察肺動脈形態學變化

MCT誘導肺動脈高壓大鼠肺組織切片，經過蘇木素-伊紅染色后與對照組比較，鏡下可見：MCT大鼠肌性肺小動脈中膜的平滑肌明顯增厚，管腔嚴重變窄。通過測量管腔橫截面積與血管腔總面積發現，MCT組管腔明顯狹窄。MCT誘導肺動脈高壓大鼠肺小動脈存在血管內膜增生和血管重構現象。見圖2A,圖2B。

圖2 肺組織HE染色光鏡觀察結果(×400)

2.3 OFQ在MCT誘導PAH大鼠肺動脈中IHC染色結果

OFQ在正常大鼠肺動脈中有少量表達，見圖3A，在經過MCT誘導肺動脈高壓后，肺小動脈增生明顯，此時OFQ表達明顯增加，主要定位于肺動脈的平滑肌細胞和細胞外基質，見圖3B。

圖3 OFQ在MCT誘導PAH大鼠肺動脈中IHC染色結果(×400)

2.4 OFQ在MCT誘導PAH大鼠血漿中檢測濃度的變化

應用ELISA檢測PHA大鼠7、14、21、28d血漿中OFQ濃度變化情況，顯示隨著時間的延長，OFQ的血漿濃度呈現逐漸升高趨勢，此項變化趨勢與肺組織中mRNA表達相一致。見表1。

表1 OFQ在MCT誘導PAH大鼠血漿中檢測濃度變化

與Control組同一時間比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

孤兒肽( orphanin FQ, OFQ)又稱為孤啡肽或者痛敏肽(nociceptin)，是一類由17個氨基酸組成的肽類物質，最初在神經系統中分離出來，實驗證明OFQ能與阿片樣受體( opioid-like receptor 1 OLR1 )特異結合，體內為 OLR1的內源性配體。早期的研究發現OFQ與神經系統的痛覺及記憶、情緒活動密切相關，在給予體外注射OFQ時發現OFQ能明顯增加實驗動物的尿量，同時減少尿中鈉離子的排泄[5]。OFQ 除了在中樞神經系統有著廣泛的分布，實驗證實腦內主要以下丘腦及邊緣系統的含量為最。OFQ的腦外組織分布主要在卵巢、脾臟、血液白細胞中，在心血管系統也有一定的分布，比如培養的血管平滑肌細胞、心房內皮細胞等[6,7]。近年來有報導，在冠狀動脈粥樣硬化疾病和心力衰竭等心血管疾病中OFQ有明顯表達，參與心血管系統的病理生理調控。目前關于OFQ與肺動脈高壓的相關性尚無研究報道，本實驗基于此應用MCT誘導大鼠肺動脈高壓模型，并對OFQ在肺動脈高壓大鼠肺組織分布及肺動脈血管中表達情況進行初步研究。

肺動脈高壓是臨床上肺動脈壓力持續進行性增加的一組癥候群，盡管不同類型的PAH發病機制各異，但是最終病理上表現為肺小動脈的重構，血管平滑肌細胞增生，管腔狹窄。MCT誘導PAH大鼠模型在發病機制研究中比較常用，容易操作，模型構建成功率高。MCT在大鼠體內經過單氧化酶轉化后，產生野百合堿吡咯，對肺動脈血管損傷，引起炎癥反應、細胞的凋亡壞死，血管增生與重構，肺小動脈增生狹窄，肺動脈壓力增高[8]。本實驗MCT誘導肺動脈高壓大鼠肺組織HE染色，顯示肺高壓組與正常組比較，肺小動脈內皮細胞腫脹，變性壞死脫落，血管中膜平滑肌增生，管壁增生增厚，血管腔內徑變小。說明MCT誘導大鼠PAH模型構建成功，為后續的研究打下了基礎。

研究證實OFQ在心血管系統血壓調節活動中發揮著重要的作用，動物實驗證實，在急性心肌缺血后小腸表達OFQ明顯增加，并且與心肌的損害程度呈現正相關，實驗表明在靜脈注射OFQ時可以明顯增加實驗大鼠的尿量，并且能夠降低尿鈉的排除，OFQ的全身性降壓作用是通過NO的舒張血管作用實現的[9]。實驗說明OFQ在循環系統中表達并且發揮著調控血壓的機制，但是在肺動脈高壓的調控機制中是否也存在OFQ的表達，尚無報道。本實驗肺動脈高壓大鼠血漿OFQ的檢測表明，OFQ在肺動脈大鼠血漿中OFQ含量與肺動脈高壓進展程度呈現密切相關，隨著MCT注射時間增加，其OFQ表達量也明顯增加。在隨后的PAH大鼠肺組織中OFQmRNA檢測也證實了上述結果。

本研究免疫組化結果顯示，OFQ在MCT誘導肺動脈高壓大鼠的肺小動脈血管壁中表達增加，定位于發生重構的肺小動脈平滑肌細胞及細胞外基質呈現OFQ陽性反應。基于OFQ在對高血壓調節機制的研究，我們推測OFQ參與肺動脈高壓發病可能是通過促進肺小動脈的血管壁平滑肌細胞增殖來參與血管壁的重構，并且OFQ的表達增加又可能會起到延緩肺高壓的作用，具體的確切機制還有待于進一步的實驗研究。

本實驗研究證明了在MCT誘導肺動脈高壓大鼠血漿中及肺組織中均有OFQ的明顯表達，隨著時間的增長極肺動脈高壓程度OFQ具有明顯變化趨勢，它可能參與了MCT誘導PAH大鼠的肺血管重構過程和肺動脈壓力調節過程。

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The investigation of orphanin FQ in pulmonary arterial hypertension rats

ZHANGHong-liang1,JIAA-na2,LIUChun-hui1,WANGHui1,FANLei1,ZHAOZhi-min1，HEZhao-fa1

(1. Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003,China;2. Emergency Medical Centre in Jiamusi, Jiamusi 154002,China)

Objective: To investigate the expression pattern of orphanin FQ in pulmonary artery and serum of rats with pulmonary arterial hypertension (PAH). Methods: Twenty rats were randomly divided into PAH group(n=15), which were intraperitoneally injected 60 mg/kg MCT and equal volume normal saline for control group (n=5). Reverse transcription-polymerase chain reaction ( RT-PCR) was used to investigate the expression level of OFQ mRNA and protein. The immunohisto chemical method was performed to confirm the localization of OFQ in pulmonary artery of PAH. Results: The expression of OFQ mRNA and protein increased significantly in MCT group, and the positive immunohisto reactive OFQ was located on endothelium as well as smooth cells. Conclusion: OFQ was increased significantly in MCT induced PAH rat. It may be as a biomarker to estimate the severity of PAH, and take part in the remodeling process of the pulmonary vascular.

pulmonary arterial hypertension; orphanin FQ; rat; monocrotaline

1.黑龍江省自然科學基金項目，編號：H201364；2.黑龍江省衛生廳項目，編號：2011-355。

張洪亮(1973～)男，黑龍江呼蘭人，博士，副主任醫師。

賀兆發(1962～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail:21652994@qq.com。

R543.2

A

1008-0104(2016)06-0019-03

2016-07-13)