疫苗生產中純化水與注射用水的質量控制研究

方朝東，邱文娜，李 磊，饒 玲，熊吉濱，李健峰

（江蘇泰州醫藥高新技術產業園區疫苗工程中心，江蘇 泰州 225300）

疫苗生產中純化水與注射用水的質量控制研究

方朝東，邱文娜，李 磊，饒 玲，熊吉濱，李健峰

（江蘇泰州醫藥高新技術產業園區疫苗工程中心，江蘇 泰州 225300）

目的 研究純化水和注射用水作為生物制品生產中主要原輔料的質量控制標準。方法 分別在純化水和注射用水不同水點取樣，按2015年版《中國藥典（二部）》最新規定進行檢測，連續3周對其進行質量監測。結果純化水和注射用水的各項質量指標均符合規定。結論 該水系統制備出來的純化水和注射用水質量優良，可用于疫苗生物制品生產。

疫苗生產；純化水；注射用水；質量控制

純化水和注射用水是疫苗等生物制品乃至藥物制劑行業中用途最廣、用量巨大的一種原輔料，其質量好壞將直接影響終產品的質量[1-2]。2015年版《中國藥典（二部）》對純化水、注射用水、滅菌注射用水的檢測方法及質量標準分別都有明確規定[3]，并修訂了純化水和注射用水微生物限度檢查項目。將營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基修訂為低營養的R2A瓊脂培養基，提高了微生物的檢出率，與《歐洲藥典》（EP）一致[4-5]。與EP不同的是，《中國藥典》暫未對純化水中細菌內毒素作明確要求。目前，國內學者主要研究純化水或注射用水中微生物限度或制水工藝方面[6-9]，尚缺乏對純化水和注射用水進行全面質量研究的報道。為保證疫苗生產工藝用水質量，筆者依據《中國藥典》要求對整個純化水和注射用水系統進行了全面質量監測。現報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

二級反滲透純化水制備系統（山東濰坊精鷹醫療器械有限公司）；純化水分配系統、多效蒸餾水機和注射用水分配系統（吉林省華通制藥設備有限公司）；1300 A2型生物安全柜（Thermo Fisher）；S230-B型電導率儀（Mettler Toledo）；5000Toci型總有機碳（TOC）分析儀（MettlerToledo）；TAL-40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；GNP-9080型隔水式恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司）；DK-S26型恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；LS-O610型烘箱（Fisher Labserv）；pH700型酸度計（Eutech）；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋（Tomy）、三聯過濾器（Sartorius，Combisart）。

1．2 試藥

鰲試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號為1412242）；細菌內毒素檢查用水（中國食品藥品檢定研究院，批號為160006-201401）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為 150601-201478）；R2A瓊脂培養基（青島高科園海博生物技術有限公司，批號為20151112）；pH＝7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號為20150208）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 純化水與注射用水的制備與分配

原水先后經石英砂和活性炭過濾器后，進入一級反滲透和二級反滲透膜，制備純化水（在線電導率儀檢測電導小于2 μs／cm），放行進入純化水罐，通過純化水分配系統送至各使用點。注射水機采用五效蒸餾器，以純化水為水源，制備的注射用水進入注射用水水罐，通過注射用水分配系統送至各使用點。純化水和注射用水分配系統總送與總回分別設有取樣閥。水系統可采取自動控制和手動控制兩種模式，一般采取自動控制模式，且水系統持續運行。

2．2 取樣計劃

純化水和注射用水的總進水口、總送水口與總回口均為每周必須監測點，每周取樣1批次，純化水和注射用水每批次均選擇2個使用點取樣，連續3周即覆蓋所有使用水點。

2．3 取樣方法

在車間正常生產和水機正常運行情況下，檢驗人員按取樣計劃負責取樣。取樣前用75%乙醇棉球擦拭取樣口內外壁，打開取樣閥排水至少3 min，滅菌玻璃瓶取水前需用水樣進行潤洗至少3次。每個取水點取3瓶平行樣品，每份取樣量不少于 300 mL，取樣結束立即蓋好瓶蓋。用于TOC檢測的水樣在取樣時應盡量取滿，以減少水面上部空氣對水樣的影響。另外，對細菌內毒素檢查用取樣試管應提前采取高溫措施以去除熱原。

2．4 檢測項目及質量標準

純化水和注射用水的檢測項目及質量標準見表1，參照2015年版《中國藥典（二部）》規定進行檢測。理化檢查項目當天完成，純化水細菌內毒素檢查與注射用水同法操作，采用凝膠試驗法。進行電導率檢測前，先將水樣溫度加溫至25℃，再用離線式電導率儀對其進行檢測。微生物限度檢查（薄膜過濾法）應在取樣結束2 h內進行，取純化水水樣10 mL，用pH＝7．0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL，配制成供試液，取10 mL供試液加入已加100 mL緩沖液的濾杯通過薄膜過濾，接著用緩沖液沖洗濾杯及膜3次（每次100 mL），取出濾膜，菌面朝上，貼于R2A瓊脂培養基表面（Φ＝90 mm），同時取緩沖液100 mL薄膜過濾，作為陰性對照，每個樣品平行做2個皿，置32℃培養箱中培養至少120 h。注射用水微生物限度檢查則取注射用水水樣100 mL直接進行薄膜過濾，其他操作步驟同純化水檢測。

表1 2015年版《中國藥典（二部）》中純化水和注射用水質量標準

2．5 結果

2．5．1 純化水和注射用水的檢測結果

連續3批次純化水和注射用水的性狀、酸堿度（pH）、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨、不揮發物和重金屬檢查項目檢測結果均合格，其細菌內毒素、電導率、總有機碳和微生物限度檢查檢測結果見表2。結果表明，純化水和注射用水系統制備和分配循環的純化水和注射用水各項質量指標均符合藥典規定。

2．5．2 純化水不同溫度、不同貯存時間檢測結果

純化水按取樣標準操作規程取樣密封后，分別在4℃和30℃條件下（綜合季節氣候變化考慮，冬天最低水溫4℃，夏天最高水溫30℃）貯存不同時間，對其電導率、TOC和微生物主要指標進行分析，同時對純化水中細菌內毒素進行檢測，結果見表3。結果表明，純化水在4℃條件下貯存72 h電導率、TOC和微生物限度各項指標均合格，細菌內毒素均小于0．25 EU／mL。隨著貯存時間的延長，其電導率波動變化不大，TOC僅呈緩慢上升趨勢。與4℃條件下比較，在30℃條件下貯存，不同點主要體現在微生物方面，純化水貯存48 h仍合格，但貯存72 h微生物總數超標。

2．5．3 注射用水不同溫度、不同貯存時間檢測結果

注射用水取樣結束后立即密封，分別在4℃、30℃和70℃不同溫度下貯存72 h，注射用水中細菌內毒素、電導率、TOC和微生物各項指標仍合格，隨貯存時間的延長，電導率和TOC在不同溫度下并無明顯變化趨勢，均未檢出微生物。見表4。

3 討論

純化水和注射用水是疫苗生產中用量巨大的輔料，《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》建議：“純化水采取循環，注射用水采取70℃以上保溫循環[10]。其在制備、貯存和使用過程中微生物容易繁殖，微生物或其代謝產物會嚴重影響藥品質量”[11]，因此加強對工藝用水的質量控制顯得尤為重要。藥典自2005年版增加微生物限度檢查項目，2010年版新增電導率、TOC項目，以及 2015年版的修訂，且 2016年版《美國藥典》（USP39）將接受應用微生物在線檢測儀對制藥用水中微生物進行實時監測的方法，均體現國內外醫藥衛生管理部門一直致力于逐步提高純化水和注射用水的質量標準，改進檢測方法以利于快速并準確地對水質情況進行監控。

表2 純化水和注射用水檢測結果

表3 純化水不同溫度下貯存檢測結果

表4 注射用水不同溫度下貯存檢測結果

本研究結果發現，純化水中微生物極少，其微生物限度值已十分接近注射用水的微生物限度值，電導率平均值不到1．20 μs／cm，遠低于藥典規定的5．1 μs／cm；TOC平均值不超過10 ppb，也是遠低于藥典規定的500 ppb；純化水各指標（包括細菌內毒素）均達到我國藥典關于注射用水的要求，實際使用中能否當注射用水使用有待進一步驗證研究。注射用水的電導率和TOC同樣遠低于藥典的規定；另外，與純化水TOC比較，注射用水TOC略高，可能與注射用水的蒸餾工藝有關，尚無明確的解釋。結果提示，經二級反滲透制得的純化水及由其蒸餾而制得的注射用水非常優質，可放心應用于疫苗等生物制品的生產。4℃低溫貯存純化水明顯能抑制水中細菌的繁殖，在常溫下保存時間最好不超過48 h。TOC隨貯存時間的增加呈緩慢上升趨勢，與孫晶晶等[12]結果一致，在一定程度上反映了純化水中微生物的情況。30℃條件下，72 h純化水中微生物超標，但細菌內毒素和TOC均未超標，可能與水中微生物暫未分解有關，純化水中微生物超標可大大增加注射用水中細菌內毒素不合格的幾率。與純化水不同，注射用水在不同溫度下貯存72 h仍合格，可能因注射用水中無微生物，檢測時可考慮增加樣品取樣量對其進一步進行驗證。

綜上所述，在生產過程中應通過測定純化水和注射用水的電導率、TOC、細菌內毒素和微生物總數等各項指標，定期對設備進行檢查、維護和更新[13]，以便系統掌握水質基本情況。綜合驗證數據和長年積累的數據，建立切合實際的電導率、TOC、微生物等指標的警戒限和糾偏限，以全面控制其質量及水系統的持續有效運行，最大限度降低因水質量問題而導致產品不合格的風險。

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[6]余 鵬，吳磊明，劉 丹，等．二級反滲透法制備純化水的質量考察[J]．中國醫藥科學，2013，3(4)：147-148．

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[12]孫晶晶，柯云玲，邵益丹，等．不同貯存條件對純化水質量的影響[J]．中國消毒學雜志，2014，31(4):353-355．

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Quality Control of Purified Water and Water for Injection in Vaccine Production

Fang Chaodong,Qiu Wenna,Li Lei,Rao Ling,Xiong Jibin,Li Jianfeng
(Vaccine Engineering Center of Taizhou Medical Hi-Tech Development Zone,Taizhou,Jiangsu,China 225300)

Objective To analyze the quality control standard of purified water and water for injection used in biological products as raw materials．M ethods The samples were collected from different sampling points respectively and examined referring to the latest regulations of ChP 2015 edition,and the quality of water was detected for 3 weeks．Results The quality index of the pure water and water for injection all accorded with the standard．Conclusion Excellent quality of water can be prepared by the water system and fits for the biological products．

vaccine production;purified water;water for injection;quality control

TQ460．6＋3

A

1006－4931(2016)11－0069－04

方朝東（1985-），男，江蘇泰州人，碩士研究生，主管藥師，主要從事生物制品研發及檢測工作，（電話）0523-86200368。

2015－10－14)