生物發酵法改善菜粕品質的研究

何小麗 李 沖 張妮婭 孫鋁輝 齊德生

生物發酵法改善菜粕品質的研究

何小麗 李 沖 張妮婭 孫鋁輝 齊德生

（華中農業大學動物科技學院，武漢 430070）

通過生物發酵的措施來改善菜粕的營養價值。采用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母、黑曲霉、芬氏纖維微菌以及從土壤中篩選的三株菌（命名為T-1、T-2、T-3）分別對菜粕進行單菌固態發酵，以降低硫苷、單寧、粗纖維和提高酸溶蛋白、蛋白質溶解度為目標篩選出高效菌株，將這些高效菌株以不同比例進行混合，獲得最優組合并優化其發酵條件，將發酵菜粕替代基礎飼糧中25%、50%、75%、100%的未發酵菜粕，通過肉雞飼養試驗驗證發酵菜粕的使用效果。結果表明：1）單菌發酵以地衣芽孢桿菌、T-1、芬氏纖維微菌的效果最優，其中地衣芽孢桿菌能顯著降低硫苷、單寧的含量（P＜0.05），T-1能顯著提高酸溶蛋白和蛋白質溶解度（P＜0.05），芬氏纖維微菌能顯著降低粗纖維的含量（P＜0.05）；2）混菌發酵以地衣芽孢桿菌、芬氏纖維微菌、T-1按1∶2∶2的比例混合時效果最優，在混合菌液總有效菌數為109CFU／mL、接種量為10%、料水比為1∶0.6、發酵溫度為37℃的條件下，發酵48 h時，硫苷降解率達89.4%（P＜0.05），單寧降解率為28.6%（P ＜0.05），粗纖維含量由10.0%降至8.6%（P ＜0.05），酸溶蛋白提高了254.0%（P ＜0.05），蛋白質溶解度提高了31.6%（P＜0.05）；3）使用發酵菜粕替代未發酵菜粕后，顯著提高了肉雞1～21日齡的平均日增重（P＜0.05），顯著降低了肉雞1～21日齡的料重比（P＜0.05）。通過生物發酵能有效降低菜粕中的抗營養因子，提高其營養價值，發酵菜粕能改善肉雞生長性能。

菜粕 微生物發酵 抗營養因子 酸溶蛋白 蛋白質溶解度 肉雞 生長性能

菜粕是一種營養價值接近于豆粕的植物性蛋白飼料資源，其蛋白質量分數為35%～45%，必需氨基酸含量豐富且組成較為合理［1］，富含鈣、磷、鎂、硒等礦物質元素，其中硒含量是植物性蛋白中含量最高的［2］。但菜粕中存在硫苷、單寧、植酸等多種抗營養因子［3-4］，在一定程度上影響了飼料的安全性，且菜粕中粗纖維含量高，蛋白質的生物利用率低［5］，動物過多采食易產生中毒，造成臟器如甲狀腺和肝臟的損傷，甚至引起畜禽死亡［6］，極大的限制了其在畜禽飼糧中的使用。為改善菜粕的飼用價值，國內外許多學者對菜粕的脫毒方法進行了大量研究，包括理化脫毒法、微生物發酵法、遺傳育種法。其中微生物發酵法效果優良，安全有效［7］。微生物發酵包括單菌發酵和混菌發酵，單菌發酵效果較為單一，菜粕品質改善效果不明顯，而混菌發酵可以同時產生多種酶，彌補單菌發酵的缺陷［8］。本試驗研究了單菌的發酵效果，篩選高效菌株并進行組合，研究了混菌發酵效果及其適宜的發酵條件，考察發酵菜粕對菜粕營養價值的影響，并通過肉雞飼養試驗驗證發酵菜粕的使用效果，以期為實際生產中菜粕資源的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母、黑曲霉：武漢某公司；芬氏纖維微菌為研究室自行保存；菜粕：湖北某油脂加工廠。

T-1、T-2、T-3為本研究室自行分離獲得的3株菌。分離方法為將菜粕放入枯樹葉堆中7 d后，用滅菌的生理鹽水，依次梯度稀釋，使其濃度梯度為10-1、10-2、10-3、10-4。分別取10-3和10-4稀釋液100 μL，加入固態營養瓊脂培養基中，涂布均勻，倒置于37℃和28℃恒溫培養箱中培養。挑取不同形態的典型菌落，分別劃線接種于新的固體培養基中，連續轉接3次分離純化菌株，取轉接3次后的生長菌株作為從土壤中篩取的菌株，分別命名為T-1、T-2、T-3。

1.2 試驗方法

1.2.1 單菌固態發酵

取30 g菜粕于250 mL三角瓶中，加入30 mL蒸餾水，混勻，分別將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母、黑曲霉、T-1、T-2、T-3（菌液濃度108CFU／mL）以10%的接種量接種于菜粕中，每組3個重復，振搖混勻后于37℃恒溫培養箱中培養48 h，每天定時翻料。發酵結束后，將發酵菜粕在65℃烘箱中烘干，室溫下回潮24 h，測定發酵菜粕中的硫苷、單寧、粗纖維、粗蛋白質、酸溶蛋白的含量及蛋白質溶解度。

1.2.2 以粗纖維為降解目標的優化試驗

考慮到單菌發酵可能對粗纖維的降解效果有限，因此，本試驗特選取了纖維素酶和對粗纖維有降解效果的芬氏纖維微菌進行了粗纖維的降解試驗。取100 U／g纖維素酶10、20、40 mg分別加入菜粕中，按1.2.1的方法進行發酵，測定菜粕中粗纖維的含量；取本研究室保存的芬氏纖維微菌（菌液濃度108CFU／mL）以10%的接種量加入菜粕中，按1.2.1的方法發酵處理，測定菜粕中粗纖維的含量。

1.2.3 混菌發酵中不同菌株配比優化試驗

根據1.2.1、1.2.2 的試驗結果篩選出3 株高效菌株，分別命名為A菌、B菌、C菌。將3種菌株以不同的添加比例加入菜粕中，添加比例如表1所示，按1.2.1的方法發酵處理，選取最優的發酵比例。

表1 菌株配比

1.2.4 混菌發酵的條件優化

按照菌液濃度、料水比、發酵時間、發酵溫度，設計4因素3水平試驗（表2），進行固態發酵，按1.2.1的方法發酵處理，確定最適發酵條件。

表2 L9（34）正交設計表

1.3 肉雞飼養試驗

選用1日齡健康科寶肉雞140羽，隨機分為5個組，每組4個重復，每個重復7羽。飼養試驗為21 d。按照上述最優發酵條件發酵菜粕，進行肉雞飼養試驗。試驗組Ⅰ使用20%未發酵菜粕（基礎飼糧），試驗組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分別用發酵菜粕替代基礎飼糧中25%、50%、75%、100%的未發酵菜粕，其余組分保持不變?；A飼糧組成及營養水平見表3。

表3 基礎飼糧組成及營養水平（風干基礎）

1.4 測定指標及方法

硫苷參照王寧惠［9］的方法進行測定；單寧參照SN／T 0800.9—1999測定；粗纖維參照GB／T 6434—2006測定；粗蛋白參照GB／T 6432—1994測定；酸溶蛋白參照QB／T 2653—2004測定；蛋白質溶解度參照DB13／T 812—2006測定。

肉雞飼養試驗于第21天時稱取試驗雞的個體重，并記錄各組雞的平均日增重、平均日采食量和飼料轉化效率。

1.5 數據統計與分析

采用SPSS 19.0對試驗結果進行分析處理，用Duncan氏多重比較進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。所有試驗結果均以平均數±標準差表示。

2 結果

2.1 單菌固態發酵

不同菌株的發酵結果見表4。由表4可知，市售五種菌株均可有效降解菜粕中的硫苷（P＜0.05），其中地衣芽孢桿菌和黑曲霉的降解率最高，達到了58.1%和60.0%，地衣芽孢桿菌能顯著降低單寧的含量（P ＜0.05），降解率為46.9%，而五種菌株對粗纖維均沒有降解效果；發酵后的粗蛋白含量都有所提高；經過枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和黑曲霉發酵后的菜粕酸溶蛋白含量均提高了100%左右，但經過五種菌株發酵后的菜粕蛋白質溶解度，除地衣芽孢桿菌外，均顯著降低（P＜0.05）。根據這些結果，本研究選擇地衣芽孢桿菌作為后續混菌發酵的菌株。

由本研究室自行分離的3株菌發酵結果可知，T-1、T-2、T-3 3株菌均能顯著降低硫苷的含量（P ＜0.05），其降解率分別為68.4%、60.3%、50.3%。發酵后的粗蛋白、酸溶蛋白都有顯著提高（P ＜0.05），酸溶蛋白含量分別提高了754.2%、643.0%、438.2%。T-1顯著提高了蛋白質溶解度（P＜0.05），T-2發酵處理后的蛋白質溶解度無變化，而T-3顯著降低了蛋白質溶解度（P＜0.05）。3種菌株對單寧和粗纖維均沒有降解效果。根據這些結果，本研究選擇T-1作為后續混菌發酵的菌株。

2.2 以粗纖維為降解目標的優化試驗

本試驗選取了纖維素酶和芬氏纖維微菌來評價其對菜粕中粗纖維的分解情況，結果見表5。由表5可知，隨著纖維素酶添加量的增加，菜粕中粗纖維的含量顯著降低（P＜0.05），添加20 mg纖維素酶的效果最好，降解率為15.7%；芬氏纖維微菌能有效降低菜粕中粗纖維的含量，粗纖維含量由11.7%降低至7.7%，降解率達到34.3%。根據粗纖維的降解效果選擇芬氏纖維微菌作為后續混菌發酵的菌株。

2.3 混菌菌株在不同比例條件下的發酵效果

由表6可知，不同的發酵比例條件下發酵效果有所差異。在發酵比例為地衣芽孢桿菌∶T-1∶芬氏纖維微菌＝1∶2∶2的條件下，發酵效果最好。硫苷的降解率為66.1%，單寧的降解率為39.8%，粗纖維的降解率為21.7%，酸溶蛋白提高了116.0%，而蛋白質溶解度仍有所下降。

表4 不同菌株固態發酵對菜粕常規營養成分的影響（干物質基礎）

表5 纖維素酶和芬氏纖維微菌對菜粕中粗纖維的降解效果（干物質基礎）

表6 混菌發酵篩選最佳發酵比例結果（干物質基礎）

2.4 混菌發酵的條件優化

在上述最佳發酵比例條件下進行發酵條件的優化，結果見表7。由表7可知，試驗組4即發酵條件為菌液濃度為109CFU／mL，料水比為1∶0.6，發酵溫度37℃，發酵時間48 h，其發酵效果最好。菜粕中硫苷降解率達89.4%，最終含量為3.58 μmol／g，單寧的降解率為28.6%，粗纖維質量分數由10.0%降為8.6%，酸溶蛋白質量分數由5.7%提高至20.8%，蛋白質溶解度由31.8%提高至41.8%。

2.5 發酵菜粕在肉雞日糧中的使用效果

由表8可知，各組肉雞平均日采食量均無顯著差異。與對照組相比，隨著發酵菜粕替代比例的增多，各組肉雞平均日增重顯著上升（P＜0.05），料肉比顯著下降（P ＜0.05）。

3 討論

3.1 不同菌株的發酵效果

微生物發酵能有效改善菜粕的品質。前人研究發現，不同菌株發酵效果有所不同?？莶菅挎邨U菌可產生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶等活性較高的酶，可以消除菜粕中的抗營養因子，同時還可以降低蛋白質的分子質量，增加小肽的含量［10-11］。酵母菌含有豐富的菌體蛋白，氨基酸組成合理，可分泌多種淀粉酶、蛋白酶、脂酶等，富含B族維生素，可作為優質的蛋白源［12］。乳酸菌發酵可產生乳酸、降低飼料pH，產生有機酸、細菌素、過氧化氫、雙乙酰的功能天然抑菌物質，從而控制大多數腐敗菌及致死菌的生長［13］。黑曲霉發酵所產生的酶類能降低菜粕中的單寧和纖維類物質［14］。

在前人試驗基礎上，本試驗選取發酵效果較好的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母和黑曲霉5種菌株進行菜粕的單菌固態發酵試驗。研究結果發現，5種菌株均能顯著降解飼料中的硫苷，其中地衣芽孢桿菌和黑曲霉效果最好，菜粕中硫苷降解效果不同主要原因在于各菌自身所分泌的酶系的不同。同時地衣芽孢桿菌還能有效降解菜粕中的單寧。通過固態發酵后，菜粕的粗蛋白、酸溶蛋白都有顯著提高，這與付敏等［15］的報道一致，這表明固態發酵過程中菌株能產生蛋白酶并作用于蛋白質，將其分解為多肽及游離氨基酸，從而改善菜粕蛋白質的品質，使菜粕的適口性更佳。同時，通過從土壤中篩選能在菜粕中生存的菌株，獲得3株菌后進行固態發酵。3株菌均能有效降解菜粕中的硫苷，而T-1菌株還能提高酸溶蛋白的含量和蛋白質溶解度，這表明T-1菌株可能在代謝中能產生更多降解菜粕中蛋白的酶類。芬氏纖維微菌是本研究室自行分離保存的菌種，據報道，芬氏纖維微菌具有分解粗纖維的能力，本試驗用纖維素酶和芬氏纖維微菌分別進行了粗纖維降解試驗，試驗結果發現，芬氏纖維微菌的效果更優于纖維素酶，可能原因是芬氏纖維微菌在發酵過程中，不斷生長繁殖，產生了更多的能降解纖維素的酶類。

3.2 菌株的組合效應

單菌發酵效果較為單一，而混菌發酵不同菌株之間可能產生協同作用，增強發酵效果。毛小偉［16］在菜粕發酵菌株的優化及固體發酵工藝的初步研究中，分別用枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、側胞芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和釀酒酵母單菌發酵菜粕，對硫苷的脫毒率分別為51.27%、54.53%、58.36%、63.76%和64.31%，而用復合菌株發酵菜粕后測得的硫苷降解率最高達到73.44%，并且粗蛋白含量的提高量較單菌發酵也顯著提高。本研究中，混菌發酵有效降低了菜粕中硫苷、單寧以及粗纖維的含量，這與單菌發酵結果相符。但是由于混菌發酵的總接種量與單菌發酵的一致，所以與單菌發酵相比，每種菌株的添加量反而降低，所以三菌混合發酵后的硫苷和單寧的降解率并沒有高于單菌發酵的結果。單菌發酵效果單一，而混菌發酵的3種菌株可能產生了互利協同作用，從而降低抗營養因子的含量，提高蛋白品質。

表7 正交設計篩選最佳發酵條件試驗結果（干物質基礎）

表8 發酵菜粕替代未發酵菜粕對1～21日齡肉雞生長性能的影響

當菌種在不同添加比例條件下，發酵效果也會有所差異。本研究中，在發酵比例為地衣芽孢桿菌∶芬氏纖維微菌∶T-1＝1∶2∶2的條件下發酵效果最好，菜粕中的硫苷、單寧和粗纖維含量均發生了顯著的降低，酸溶蛋白的含量有所提升，而蛋白質溶解度卻有所下降，所以有必要對混菌發酵的發酵條件進行優化。

3.3 生物發酵工藝的優化

不同微生物有其適宜的生長條件，在不同發酵條件下，發酵效果存在差異。付敏等［15］研究發現菌種接種比例和料水比對發酵結果具有顯著影響，隨著菌液添加比例的增加，小肽和游離氨基酸含量顯著增加；Batal等［17］研究發現發酵底物含水量對固態發酵過程中植酸酶的產生具有顯著影響，在含水量為60%時植酸酶的產量最高。本試驗對菌液濃度、料水比、發酵溫度和發酵時間等條件探究其發酵效果，發現不同發酵條件下發酵效果不一樣。

發酵溫度是影響固態發酵的一個重要因素，發酵溫度會影響微生物的生長繁殖，酶的活性以及代謝產物的形成［18］。本試驗的結果表明，最適的發酵溫度為37℃，因為本試驗的復合菌株包括地衣芽孢桿菌、T-1和芬氏纖維微菌，這3株菌的最適生長溫度均為37℃，此時既能促進菌株的生長，又能使菌體代謝產生的活性物質含量達到最大，從而使發酵效果達到最優。

底物含水量的多少對微生物的生長及其代謝能力有重要影響。提高發酵初始含水量，可以增加發酵底物營養物質的溶解和微生物代謝產物的擴散以促進微生物的生長［19］，還可以增加水解酶的產生并促進水解酶的擴散［20］；但初始含水量過高會造成發酵底物多孔性的降低，導致氧傳質和熱傳質的降低［20］。同時會造成顆粒結塊、通氣不暢和染菌。通常，在一定范圍內，活性物質的含量隨著含水量的增加而增加。本試驗表明，在料水比為1∶0.6時發酵效果最好，在此條件下，既能保證微生物生長的需要，又不會造成菜粕結塊，通氣不暢等影響。

菌液接種量是指接種菌液的體積或菌液濃度。接種量過低，菌體生長繁殖速度慢，不利于生成代謝產物降解抗營養因子；而接種量過大，致使菌體生長速度加快，會消耗大量的營養物質，造成損失。本試驗通過提高菌液濃度，縮短了菌種生長繁殖及生成代謝產物的時間，從而縮短發酵時間。試驗結果表明，菌液濃度為109CFU／mL時發酵效果最好。

隨著發酵時間的延長，菜粕中有毒有害物質減少的越多，但時間過長，則會影響菜粕中其他營養成分，且周期相應延長［21］。周世寧等［22］使用曲霉R10發酵菜粕24 h，發現脫毒率僅有30%；Rakariyatham等［23］試驗發現當發酵時間為60 h和96 h時，硫苷被徹底降解。目前為保證良好脫毒效果，又縮短生產周期，一般采用發酵24～48 h。本試驗的結果表明，發酵時間為48 h發酵效果最好，此時硫苷的含量僅為3.58 μmol／g，降解率達到最高。

3.4 發酵菜粕在肉雞飼料中的應用問題

發酵菜粕在肉雞飼料中的應用有許多研究，余勃等［24］研究固態發酵菜粕替代日糧中豆粕對肉仔雞生長性能的影響，分別用5%、10%和15%的固態發酵菜粕替代豆粕，結果表明日糧中使用15%的發酵菜粕后肉雞前期和后期的日增重均呈顯著下降趨勢，但添加量不超過10%時，對其日增重和飼料轉化效率均無顯著影響，日糧中使用15%以內的發酵菜粕對肉雞肝臟和甲狀腺指數也無顯著影響，所以固態發酵菜粕可以替代日糧中的部分豆粕，但替代量以不超過10%為宜。

本研究中，分別以25%、50%、75%和100%的發酵菜粕替代日糧中未發酵菜粕，緩解了未發酵菜粕對肉雞1～21日齡平均日增重和料重比的影響。這一結果表明，通過固態發酵處理能提高菜粕的營養利用率，發酵處理后降低了菜粕中抗營養因子的含量，產生的酸溶蛋白更有利于動物的吸收，從而提高了菜粕的營養價值，改善了肉雞的生長性能。

4 結論

4.1 本試驗以降低硫苷、單寧、粗纖維和提高酸溶蛋白、蛋白質溶解度為目標篩選出了地衣芽孢桿菌、T-1和芬氏纖維微菌等3株高效菌株。

4.2 在發酵比例為地衣芽孢桿菌∶芬氏纖維微菌∶T-1＝1∶2∶2的條件下發酵效果最好。在接種量為10%，菌液濃度為109CFU／mL，料水比＝ 1∶0.6，發酵時間為48 h，發酵溫度為37℃的條件下發酵效果最優。

4.3 與未發酵菜粕相比，發酵菜粕顯著提高了肉雞平均日增重（P＜0.05），顯著降低了肉雞料重比（P＜0.05），有效改善了肉雞的生長性能。

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Biological Fermentation to Improve the Quality of Rapeseed Meal

He Xiaoli Li Chong Zhang Niya Sun Lühui Qi Desheng
（Huazhong Agricultural University，College of Animal Science and Technology，Wuhan 430070）

The study was conducted to improve the nutritional value of the rapeseed meal by biological fermentation.Bacillus subtilis，Bacillus licheniformis，Lactobacillus plantarum，Saccharomyces cerevisiae，Aspergillus niger，Cellulosimicrobium funkei strain and three strains（named as T-1，T-2，T-3）screened from soil were used to ferment rapeseed meal respectively in a single fungus solid manner.The strains which got low glucosinolate，tannic，crude fiber content and improved TCA，protein solubility in rapeseed meal after fermentation were selected and mixed in different proportions，to obtain the optimal combination and optimized fermentation conditions，The broilers wre fed basal diets in which part of unfermented rapeseed meal were replaced by 25%，50% ，75% ，100%fermented rapeseed meal.The results showed that：1）Single strain fermentation with Bacillus licheniformis，Cellulosimicrobium funkei strain and T-1 could get the best effects.Bacillus licheniformis could reduce glucosinolate，tannic contents significantly（P ＜0.05），T-1 could improve TCA and protein solubility （P ＜0.05），Cellulosimicrobium funkei strain can reduce crude fiber significantly（P ＜0.05）；2）Mixed fermentation with Bacillus licheniformis，Cellulosimicrobium funkei strain and T-1 could get optimal effect by 1∶2∶2 ratio.Fermented rapeseed meal 48 h under 37 ℃ with effective bacteria of 109CFU／mL，10%inoculum size，feed water ratio in 1∶0.6，the degradation rate of glucosinolate could reach to 89.4% （P ＜0.05），tannic degradation rate of 28.6% （P ＜0.05），crude fiber decreased to 8.6%from10.0%（P ＜0.05），TCA improved 254.0% （P ＜0.05），protein solubility improved 31.6%（P ＜0.05）；3）Fermented rapeseed meal significantly increased the average daily gain of 21-day-old broiler（P＜0.05），and significantly reduced the feed conversion ratio （P ＜0.05）.Biological fermentation can effectively reduce the anti-nutritional factors in rapeseed meal，and improve its nutritional value，fermented rapeseed meal can improve broiler performance.

rapeseed meal，microbial fermentation，anti-nutritional factors，TCA，protein solubility，broiler，growth performance

S816.4

A

1003-0174（2016）11-0085-07

飼料資源開發與高效利用關鍵技術研發與集成示范（2011BAD26B01-3）

2015-04-15

何小麗，女，1990年出生，碩士，動物營養與飼料科學

齊德生，男，1965年出生，教授，飼料安全與飼料生物技術