黑麥多酚提取工藝及體外清除亞硝酸鹽研究

郝教敏 楊文平 李紅玉 楊珍平 韓雪梅

黑麥多酚提取工藝及體外清除亞硝酸鹽研究

郝教敏1楊文平2李紅玉3楊珍平4韓雪梅1

（山西農業大學食品科學與工程學院1，太谷 030801）
（華北理工大學生命科學學院2，唐山 063000）
（山西農業大學科技處3，太谷 030801）
（山西農業大學農學院4，太谷 030801）

為優化黑麥多酚提取工藝，并評價其體外清除亞硝酸鹽能力，試驗比較了水和乙醇對黑麥多酚得率的影響，確定乙醇為提取劑；進一步采用單因素試驗和三元二次正交試驗，分析乙醇濃度、乙醇用量、提取溫度、提取時間對黑麥多酚得率的影響并優化工藝參數；最后對黑麥多酚體外清除亞硝酸鹽能力進行測定。結果表明，體積分數50%乙醇溶液提取黑麥多酚的最優工藝參數為：乙醇用量59 mL（即料液比1∶11.8），54℃水浴48 min，得率2.10 mg／g；三因素對黑麥多酚得率的主效應是乙醇用量（X3）＞提取溫度（X1）＞提取時間（X2）；交互效應為X1X3＞X2X3＞X1X2；黑麥多酚具有較強的清除亞硝酸鹽能力，當提取液用量超過5 mL時，清除率可達84%以上。

黑麥 黑麥多酚 提取工藝 亞硝酸鹽 清除率

天然植物抗氧化劑相比人工合成的抗氧化劑更安全、健康和無毒，已引起人們的廣泛關注并成為當今食品科學發展的必然趨勢。植物多酚是植物體內復雜酚類次生代謝物，具有多元酚結構［1］，是一類具有獨特生理活性和藥理活性的天然產物，主要存在于植物的皮、根、莖、葉和果實中。研究表明，植物多酚具有抗氧化、抗病毒、抗輻射、抗癌、抑菌、抑制心腦血管疾病等生物活性功能［2-4］，對清除亞硝酸鹽也有一定的作用［5］，在食品、制藥、生化及日化等領域具有廣闊的應用前景。黑麥又稱裸麥、黑小麥，為禾本科黑麥屬1年生草本植物，富含淀粉、膳食纖維（可達13%～19%）［6］、脂肪、蛋白質、B 族維生素和磷、鉀等多種重要營養素及多種生物活性物質［7-8］，

具有較高的營養價值和保健作用，開發和利用潛力較大。但有關黑麥多酚的提取工藝及清除亞硝酸鹽能力的研究甚少。本研究采用水浴浸提法，通過單因素試驗和三元二次正交試驗分析了黑麥多酚提取的主要影響因素，并優化了提取的工藝條件，同時，考察了黑麥多酚清除亞硝酸鹽的能力。為黑麥深加工及黑麥多酚的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

1.1.1 試驗原料

黑麥（Secale cereale L.，禾本科，黑麥屬）籽粒，引自加拿大的“黑引1號”品種，由山西農業大學農學院提供。

1.1.2 試劑

無水碳酸鈉、無水乙醇：天津市天力化學試劑有限公司；水合沒食子酸：成都市科龍化工試劑廠；福林酚、對氨基苯磺酸、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉等均為分析純。

1.1.3 儀器

FZ102微型植物粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；721可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；TDL-4離心機：上海安亭科技儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料處理

將去雜去劣篩選干凈的黑麥籽粒，按一定的比例加水潤濕，一段時間后，用植物組織粉碎機按14%出麩率進行粉碎，過篩，風干。將風干后的黑麥粉收入容器中，避光低溫保存備用。

1.2.2 沒食子酸標準曲線的繪制

準確稱取水合沒食子酸40 mg，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，移入棕色瓶。再從棕色瓶中吸取10 mL，定容到100 mL，得質量濃度0.040 mg／mL 的沒食子酸標準使用溶液。分別吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 沒食子酸標準使用溶液于25 mL比色管中，各管分別加蒸餾水至3.5 mL，再分別加入1 mL福林酚試劑，靜置3 min，用5%（m／V）碳酸鈉溶液定容至刻度25 mL，搖勻，靜置15 min（避光）后，以0.0管的溶液為空白，于765 nm處測定吸光值。以吸光度值為橫坐標，沒食子酸的質量為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 黑麥多酚的提取和測定

準確稱取黑麥粉5.0 g，按一定料液比加入提取劑，于一定溫度下水浴浸提一定時間，室溫下靜置28 h，過濾，得浸提液。取浸提液1 mL于25 mL比色管中，然后按照標準曲線的繪制方法，以不加浸提液的空白處理作參比，于765 nm處測定吸光值。查標準曲線獲得浸提液中沒食子酸的毫克數，按照公式計算黑麥多酚得率（mg／g）。

黑麥多酚得率＝提取液中沒食子酸的質量／mg／樣品的質量／g

1.2.4 試驗設計

1.2.4.1 提取劑選擇

準確稱取5.0 g黑麥粉10份，分別裝入10個干凈的錐形瓶內，其中5個瓶內依次加入體積分數為50%乙醇溶液40、50、60、70、80 mL；其余5 個瓶內分別加入相應體積的蒸餾水，40℃水浴30 min后取出，靜置，過濾，后續步驟參照1.2.3操作。重復3次。

1.2.4.2 單因素試驗及三元二次正交回歸設計

根據1.2.4.1的試驗結果，選擇乙醇為提取劑，設乙醇體積分數（%）、乙醇用量（mL）、浸提溫度（℃）及浸提時間（min）4個單因素試驗（表1）。依單因素試驗結果，確定3個主要影響因素，采用三元二次正交回歸設計優化提取工藝。同時將正交組合中獲得的最大濃度黑麥多酚粗提液，稀釋100倍待用。

1.2.5 亞硝酸鹽清除率測定

采用對氨基苯磺酸鹽酸萘乙二胺分光光度法。準確量取2份5μg／mL亞硝酸鈉標準使用溶液2 mL，置于50 mL容量瓶中；1份作空白對照，1份加入一定量的黑麥多酚稀釋液，搖勻，反應一定時間；然后分別加入0.4%對氨基苯磺酸溶液2 mL，搖勻，靜置5 min；再分別加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，用蒸餾水定容至刻度線，靜置15 min；以蒸餾水作參比，于540 nm處測得吸光度。

亞硝酸鹽清除率＝［（A2-A1）／A2］×100%

式中：A1為黑麥多酚稀釋液與2%亞硝酸鈉溶液的混合液的吸光度值；A2為空白對照的吸光度值。

1.3 數理統計與分析方法

對所得數據用Excel軟件整理制表，用Sigma-Plot10.0繪圖軟件制圖，用SAS9.1.3 統計分析軟件進行方差分析、Duncan＇s多重比較、RSREG回歸分析、G3D過程分析等。

2 結果與分析

2.1 水提取劑與50%乙醇提取劑對黑麥多酚提取效果的影響

由圖1可以看出，在同一料液比下，50%乙醇提取的黑麥多酚得率更高。說明黑麥多酚得率與溶劑的極性有關，可能的原因是多酚在植物體內通常與蛋白質、多糖等以氫鍵和疏水鍵形式形成穩定的化合物，而有機溶劑具有氫鍵斷裂的作用，因此乙醇溶劑更利于黑麥多酚的溶出。故選擇乙醇提取劑進行后續單因素試驗。

表1 單因素試驗設計

圖1 提取劑對黑麥多酚得率的影響

2.2 單因素試驗結果分析

由圖2可以看出，4個單因素對黑麥多酚得率均有顯著的影響（P＜0.05），且除浸提溫度外均符合開口向下的拋物線模型。其中，50%乙醇溶液提取的黑麥多酚得率最高，這可能與黑麥多酚所攜帶的酚羥基（-OH）數量有關，數量越多，極性越強。當乙醇濃度較高時，提取劑以乙醇相為主，極性較強；當乙醇濃度較低時，提取劑以水相為主，極性較弱，這2種情況下可能均難以將黑麥多酚完全浸提出來。當50%乙醇溶液的用量達到60 mL（即料液比1∶12）時，黑麥多酚得率最大，表明樣品中的多酚可能已完全分布到提取劑中；繼續提高乙醇溶液用量，反而抑制了黑麥多酚在溶劑中的分散溶出。在20～50℃范圍內，隨著溫度升高，多酚得率呈明顯上升趨勢（P＜0.05），這是由于溫度升高，分子運動加速，氫鍵更易斷裂，多酚的滲透、溶解、擴散速度也加快，因而酚類物質更易于從原料中溶出［9-10］；當溫度達到60℃，溶劑蒸發加快，在一定程度上抑制了多酚的溶解；進一步提高溫度，伴隨溶劑的快速蒸發，發生淀粉糊化、蛋白質變性、多糖等物質溶出生成膠體物質等，導致提取液渾濁度增加，吸光值陡升。在前3個因素選擇確定的基礎上，以浸提50 min時黑麥多酚得率最大，表明此時黑麥多酚已全部溶出；繼續延長浸提時間，可能會引起多酚類物質分解氧化等［6］。

圖2 各因素對黑麥多酚得率的影響

2.3 正交回歸試驗結果分析

根據單因素試驗結果，確定乙醇體積分數為50%，進一步采用三元二次正交設計（表2），分析提取溫度（X1）、提取時間（X2）、乙醇用量（X3）及其交互作用對黑麥多酚得率的影響，以獲得最佳工藝。

表2 三元二次正交設計的因素水平編碼、試驗組別及試驗結果（n＝3）

采用SAS9.1.3軟件RSREG過程對表2三因素編碼水平與多酚得率指標進行Y＝B0+∑BjXj+∑BijXiXj+∑BjjX2j的回歸分析，得多酚得率指標（Y）對試驗因素X1～X3編碼間的回歸方程：

對回歸模型（1）進行方差分析與F檢驗可知，F擬合＝89.89（P ＜0.000 1），達到極顯著水平；回歸方程的決定系數R2＝0.992 6，說明模型方程差異顯著，且擬合較好。因此可以用該模型分析各工藝參數對黑麥多酚得率的影響。

對回歸模型（1）的偏回歸系數進行顯著性檢驗表明，三因素的的一次項、二次項及交互項對多酚得率的影響均達到極顯著水平（P＜0.001），其中二次項（Xj2）均為負效應，再次表明三因素對多酚得率的影響均符合開口向下的拋物線模型。

對三因素主效應作顯著性檢驗表明，三因素對多酚得率的影響均達到極顯著水平（P＜0.001），且作用順序依次為乙醇用量＞提取溫度＞提取時間。

采用降維法將式（1）中的某一因子Xj固定在“0”編碼水平，獲得多酚得率與另外兩因子的偏回歸模型見式（2）、式（3）、式（4）。

通過SAS軟件的G3D過程分析得出，水浴醇提黑麥多酚時，提取溫度的作用大于提取時間的作用；乙醇用量的作用大于提取溫度的作用，也大于浸提時間的作用。當溫度較低、時間較短時，提高溫度，延長時間，有利于加快分子運動，促進多酚物質充分溶出，多酚得率提高；當溫度較低、乙醇用量較少時，適當提高溫度，加大乙醇用量，有利于促進多酚物質向溶劑溶出、擴散；當這些因素達到一定程度后，繼續提高溫度，延長時間，或增加溶劑用量，反而會降低多酚得率。

由SAS軟件RSREG過程中三因素典型性分析結果可知，提取溫度（X1）、提取時間（X2）和乙醇用量（X3）分別為54℃（對應編碼值0.358）、48 min（對應編碼值-0.072）和59 mL（對應編碼值-0.024）時，黑麥多酚得率最大，值為2.10 mg／g。經實測驗證該最佳工藝的提取得率為2.09 mg／g，標準偏差為0.007。所以該模型較好地反映了各因素對黑麥多酚得率的影響。

2.4 黑麥多酚對亞硝酸鹽的清除能力分析

將正交組合中獲得的最大濃度黑麥多酚粗提液（0.244 mg／mL）稀釋100 倍后，進行亞硝酸鹽清除能力測定（圖3）。結果表明，黑麥多酚稀釋液對亞硝酸鹽具有明顯的清除作用（P＜0.05）；當其用量為5 mL時，清除率達84.30%；繼續增加用量，對亞硝酸鹽清除率變化不大，這可能是由于黑麥多酚與亞硝酸鹽之間的反應已達到相對飽和狀態所致。

圖3 黑麥多酚對亞硝酸鹽的清除能力

3 討論

3.1 黑麥多酚水浴浸提工藝探討

水浴浸提法提取植物多酚，常用的溶劑有水、甲醇、乙醇、丙酮，考慮到甲醇和丙酮的毒性較大，所以本研究僅比較了水和乙醇溶液的多酚提取效果，并確定乙醇溶液為提取劑。根據多酚來源不同，浸提劑種類及濃度、浸提溫度及時間等提取條件和主要影響因素均有所不同［11-13］。本研究結果表明，影響黑麥多酚得率的主效應是乙醇用量＞提取溫度＞提取時間，而且三因素之間亦存在明顯的互作效應。當50%乙醇用量、提取溫度、提取時間的最適條件分別為59 mL（即料液比1∶11.8）、54 ℃、48 min 時，多酚得率最大（2.10 mg／g）。乙醇溶劑提取多酚，操作簡單易行，提取率相對較高，所得產品更安全，成本較低，因此可進行工業化生產。

3.2 黑麥多酚清除亞硝酸鹽能力及其物質組成探討

亞硝酸鹽是生成亞硝胺的前體物質，而亞硝胺（也稱N-亞硝基化合物）具有強致癌性［14］，故亞硝酸鹽的存在危害人體的健康。據資料表明，上市的各類熟肉制品的合格率平均僅為60.4%～87.0%，添加天然無毒的物質清除亞硝酸鹽已成為當今一個熱門研究課題［15］。Tsai等［16］和Huang 等［17］研究表明綠茶、中草藥、紅薯葉提取物都具有清除亞硝酸鹽的作用。本研究結果顯示，黑麥多酚具有較強的清除亞硝酸鹽能力，且隨著用量的增加清除率增大。前人研究表明，黑麥中含有阿魏酸、黃酮、烷基間苯二酚、木質素（也叫木酚素）、植物甾醇類等生理活性物質［7-8，18］，其中的阿魏酸對于過氧化氫、超氧自由基、羥基自由基、過氧化亞硝基具有強烈的清除作用［19-20］；烷基間苯二酚（ARs）僅麥類中含量較高，能夠清除自由基和抗脂質氧化；木質素分子中常含有醇羥基、酚羥基、甲氧基、亞甲二氧基、羧基及內酯等基團，因而也具有這些功能基團的性質和反應。此外，黑麥多酚中還包含生育酚、麥黃酮等。本文作者通過高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-C18柱），也初步判斷黑麥多酚包含有阿魏酸、綠原酸、麥黃酮等物質成分。因此，后續研究將著重于黑麥多酚物質成分的定性及定量檢測。

4 結論

黑麥多酚水浴浸提的最佳工藝參數為：乙醇體積分數50%、料液比1∶11.8、54 ℃水浴48 min，多酚得率2.10 mg／g。經實測驗證該最佳工藝的多酚得率為2.09 mg／g，標準偏差為0.007。黑麥多酚提取液對亞硝酸鹽有明顯的清除作用，隨著多酚用量的增加，清除率快速增加，可達84%以上。

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Extraction Process of Rye Polyphenols and Its Scavenging Capability to Nitrite in vitro

Hao Jiaomin1Yang Wenping2Li Hongyu3Yang Zhenping4Han Xuemei1
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University1，Taigu 030801）
（College of Life Science，North China University of Science and Technology2，Tangshan 063000）
（Department of Science and Technology，Shanxi Agricultural University3，Taigu 030801）
（College of Agriculture，Shanxi Agricultural University4，Taigu 030801）

In order to optimize the extraction process of rye polyphenols and to evaluate scavenging capability to nitrite in vitro，ethanol was ascertained as an extracting solvent by comparing the effects of distilled water with ethanol on the extraction yield of rye polyphenols.Then，single-factor experiment and ternary quadratic orthogonal design were adopted to analyze the effects of ethanol concentration，ethanol volume，extraction temperature and extraction time on the yield of rye polyphenols and to optimize extraction process parameters.In final，the scavenging rate of rye polyphenols to nitrite in vitro was determined.Results showed that optimum process parameters of 50%ethanol-water solution extracting rye polyphenols were as followed：ethanol volume 59 mL （i.e.，the ratio of material and solvent was1∶11.8），extracted in the water bath for 48 min at 54 ℃，and the yield of rye polyphenols was2.10 mg／g.The major effects of three factors on the yield of rye polyphenols were ethanol volume（X3）＞extraction temperature（X1）＞extraction time（X2），the mutual effects between two factors were X1X3＞X2X3＞X1X2.Rye polyphenols had a stronger scavenging capacity to nitrite，and the scavenging rate reached above 84%when the dosage of extracting solution was more than 5 mL.

Rye（Secale cereale L.），rye polyphenols，extraction process，nitrite，scavenging rate

S512.5；TS21

A

1003-0174（2016）11-0118-06

山西省科技攻關（20110311001-4），山西農業大學校育種基金（2014yz2-8）

2015-01-28

郝教敏，男，1974年出生，副教授，天然植物活性成分在肉制品中的應用

楊珍平，女，1973年出生，教授，植物資源學及植物生理生態