凍存臍帶間充質干細胞的臨床前制備

何 潔，趙 晶，王金祥，蔡學敏，龐榮清，潘興華

凍存臍帶間充質干細胞的臨床前制備

何 潔，趙 晶，王金祥，蔡學敏，龐榮清，潘興華

目的將凍存的人臍帶間充質干細胞（UC-MSCs）制備成一種復蘇后可直接用于臨床的制劑，并進行質量檢定。方法從種子細胞庫復蘇凍存的UC-MSCs，待細胞培養至P3代時，收集UC-MSCs，按照4×107/劑的規格加入含5%人血白蛋白、10%DMSO、85%復方電解質溶液的細胞保護液，形成制劑，并對其進行質量檢定，包括無菌檢測、支原體檢測、細胞內外源致病因子檢測、內毒素檢測、免疫表型檢測、穩定性檢測、異常免疫學反應檢測以及殘留物檢測。結果制備的UC-MSCs制劑無菌、無支原體污染，無內外致病因子，毒素＜2 EU，能抑制異源淋巴細胞的增殖，抑制率隨臍帶間充質干細胞數量增加而增大。牛血清殘留＜50 ng/袋，制劑凍存前細胞活性＞90%，復蘇后活性＞85%。結論按照此方法制備的UC-MSCs制劑符合臨床治療要求的質量檢定標準。

臍帶；間充質干細胞；制劑；制備；質量檢定

臍帶來源的間充質干細胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)因具有來源廣泛、采集方便、不受供體年齡限制以及可以大規模制備等優點[1]，而成為間充質干細胞研究的熱點，可以用于治療脊髓損傷、腦缺血、移植物抗宿主病以及自身免疫性疾病等的治療[2-4]。隨著干細胞的廣泛應用，為了適應臨床需要，各種干細胞產品相繼被開發，作為一種新型的生物制劑。因為hUC-MSCs具有活細胞屬性，從分離培養到鑒定最終形成制劑的每一個環節都有可能會影響其質量，也直接決定著后續臨床治療的安全性和有效性。目前，已經有較多關于hUC-MSCs制備以及治療方面的研究報告，但尚未建立制劑制備、檢定的技術規范以及質量控制標準。所以需對hUC-MSCs制劑的制備進行標準化研究和質量檢定。本課題在前期已經建立了一套標準化的UC-MSCs制備鑒定技術，并在此基礎上形成標準化的hUC-MSCs細胞庫，本研究旨在如何將凍存的UC-MSCs制備成一種復蘇后可直接用于臨床的制劑，為臨床應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設備 UC-MSCs來源于本中心干細胞庫；DMEM/F12培養液（Hyclone公司），胎牛血清（FBS）和0.25%trypsin-EDTA（BI公司）；復方電解質溶液（勃脈力A，上海百特醫療用品）；人血白蛋白（廣東衛倫生物制藥有限公司）；DMSO（Bioniche Pharman,USA LLC公司）；低分子肝素鈣（葛蘭素史克有限）；鱟試劑及檢查用水（湛江安度斯生物有限公司）；內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院）；HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、MP、TP熒光定量PCR試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司）；豬細小病毒檢測試劑盒（西班牙Ingenasa公司）；定量檢測牛血清白蛋白（BSA）試劑盒（Cygnus）；MTS檢測試劑盒（Promega公司）。

1.2 種子細胞的復蘇 從液氮罐中取出hUCMSCs凍存管，核對好批號后，迅速置于37℃水浴中，期間不斷晃動，使管中的細胞懸液迅速融化，待細胞懸液完全融化后，在超凈工作臺內加入10倍體積以上的生理鹽水低速離心，除去上清后再重復用培養液洗一次。胎盼藍染色檢測細胞活性、計數。之后接種培養瓶，放入5%CO2、37℃的培養箱中靜置培養。

1.3 hUC-MSCs制劑的制備 取第3代細胞(P3)計數，采用臺盼藍拒染法進行細胞活性測定。當活性大于90%時，按照4×107/劑的規格，加入含有5%人血白蛋白、10%的DMSO的勃脈力A 20 ml，充分混勻后緩慢裝入凍存袋中，待細胞完全裝入袋后，輕輕擠壓凍存袋排除多余氣體，然后密封，貼好標簽，注明生產批號、生產日期、規格。把密封好的袋裝制劑放入程序降溫盒中，置于-70℃冰箱，24 h后移入液氮中保存備用。臨床擬使用劑量為：1×106個/kg。臨床使用時，把凍存袋從液氮取出迅速置于37℃水浴中，期間不斷晃動凍存袋，使其中的細胞懸液快速融化。待細胞懸液完全融化后，仔細核對袋上標簽注明的批號、姓名、數量，確認后用勃脈力A進行五倍稀釋，并根據1050 IU/（4×107）個細胞添加低分子肝素鈣，低溫保存備用。

1.4 hUC-MSCs的質量檢定

1.4.1 無菌檢測 采用全自動微生物培養法，取適量制劑懸液加入需氧培養瓶和厭氧培養瓶中，置于全自動微生物培養檢測系統，37℃培養。

1.4.2 病原體檢測 采用定量PCR法檢測支原體；采用Q-PCR法檢測人源特定病毒（HIV、HBV、HCV、EBV、CMV）；采用ELISA法檢測豬細小病毒；依據 《中華人民共和國藥典》2010年版三部附錄ⅫB細菌內毒素檢查法檢測內毒素。

1.4.3 牛血清殘留量檢測 使用定量檢測牛血清白蛋白（BSA）酶聯免疫試劑盒，對制劑的牛血清殘留量進行檢測。每次檢測同時進行試驗有效性確認。判定標準為每個制劑中牛血清殘留量≤50 ng。

1.4.4 異常免疫學反應檢測 制劑按照1×104個/ml hUC-MSCs接種于6孔板中，2 h貼壁后，按照hUCMSCs∶外周血T淋巴細胞（PBLCs）為1∶1、1∶5、1∶10、1∶20的比例加入PBLCs，在PHA刺激的作用下，培養72 h后，MTS一步法檢測UC-MSCs對CD3+T淋巴細胞增殖抑制作用。

1.4.5 穩定性檢測 分別于制劑凍存后的2 w、1個月、3個月、6個月后，分別復蘇同一批號的細胞，計數存活細胞數量，胎盼藍染色后檢測其活性。

2 結果

2.1 復蘇后hUC-MSCs的形態觀察 復蘇后的hUC-MSCs，倒置相差顯微鏡下觀察呈圓形透亮的單個細胞，培養2 h逐漸貼壁；3～4 d換液1次，待細胞均勻分布生長至80%～90%融合時，可見大量成纖維樣細胞呈漩渦狀、網狀、輻射狀生長（圖1）。

圖1 倒置相差顯微鏡下hUC-MSCs（P3）形態

2.2 hUC-MSCs制劑的制備 hUC-MSCs制劑是一種復蘇后直接用于臨床治療的細胞制劑，所以需對制劑制備過程進行原始記錄并存檔（圖2）。規格：4×107/20 ml/袋；性狀：微黃色細胞混懸液；包裝：凍存袋；保存方式：液氮保存。

圖2 hUC-MSCs制劑

2.3 hUC-MSCs制劑質量檢定結果 從表1可見，各檢測項目全部合格。

2.4 hUC-MSCs制劑的異常免疫學反應 從圖3可見，hUC-MSCs制劑對人T淋巴細胞增殖具有抑制作用，且抑制作用隨著hUC-MSCs數量的增加而增大。

2.5 hUC-MSCs制劑的穩定性 從表2可見，hUC-MSCs制劑保存2 w～6個月，hUC-MSCs制劑中的細胞數量和活性沒有顯著變化。

圖3 PHA刺激后hUC-MSCs對CD3+T淋巴細胞增殖抑制作用

3 討論

基于干細胞廣泛的應用前景，為適應臨床使用的需要，各種干細胞制品制劑不斷被開發而推向市場，干細胞制劑越來越多的應用于細胞治療的領域。目前為止，國際上已有多款的相關干細胞產品上市并批準進入臨床[5]，這些都標志著干細胞從實驗室技術向著藥物的方向發展。在我國，干細胞臨床研究已是如火如荼，但由于細胞來源和各實驗室制備條件的差異，對干細胞制劑的質量還缺乏系統性的評價和規范性的要求。2015年8月，國家衛計委和國家食品藥品監督管理局聯合發布了《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則 (試行)》，目的就是要規范干細胞制劑的臨床前研究、確保干細胞制劑的質量可控性以及治療的安全性和有效性。本研究制備的臨床級hUC-MSCs制劑，是將一定濃度的干細胞懸液與細胞凍存保護液按比例混合制備后，分裝于適宜冷凍的凍存袋，放于液氮中保存，復蘇后可直接用于臨床的制劑。作為一種不同于傳統藥物制劑的全新藥物制劑形式，因為其具有活細胞屬性，所以有非常強的特殊性，更需要通過全面的質量檢測和控制。

表1 hUC-MSCs制劑質量檢定結果

表2 hUC-MSCs制劑質量穩定性結果

在干細胞制劑的臨床應用中，最基本的要求就是確保制劑的無菌、無內毒素、無內外源致病因子。在本研究中，細菌和內毒素檢測參照了2010版藥典規定的方法檢測，方法簡易又經濟，有可操作性和實用性。在對內外源致病因子的檢測中，除了豬細小病毒，均采用了定量PCR的方法，從基因水平對病毒進行檢測，確保安全。但由于有些病毒存在窗口期的問題，所以關鍵措施還是需要完善供者信息以便之后隨訪，排除病毒處在窗口期漏檢的因素。

近幾年來，免疫調節成為間充質干細胞最受關注的原因之一，因為其免疫原性低且本身具有免疫調節功能，可以抑制T、B淋巴細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞的成熟和功能[6-8]，因此，不論是自體還是同種異體的MSCs，用于治療一般都不會引起宿主的免疫反應，本研究應用MTT法檢測了異體來源的UC-MSCs對于人T淋巴細胞的抑制作用，對于監測UC-MSCs免疫調節功能提供了簡便可行的檢測方法，保證了臨床使用的有效性。

干細胞制劑最突出的特點就是有效性成分是活細胞，能發揮生物學效應的前提是具有一定穩定性，因此，長期在液氮保存，其活性需要長期的監測。本研究對制備的臍帶間充質干細胞制劑的活性在凍存后2 w～6個月復蘇后檢測其活性，均不低于90%。

此外，牛血清是培養過程中培養基的添加物，根據《指導原則》在制劑制備過程中堅持少加甚至不加的原則，盡可能少引入異源的病毒和致敏源，因此，對牛血清的殘留需控制在一定范圍內來確保制劑的安全性。

[1] Wang L,Tran I,Seshareddy K,et al.A comparison of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells for cartilage tissue engineering[J].Tissue Eng Part A,2009,15(8):2259-2266.

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Pre-clinical preparation of cryopreserved UC-MSCs

He Jie,Zhao Jing,Wang Jinxiang,Cai Xuemin,Pang Rongqing,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China;Yunnan Stem Cell Engineering Laboratory,Kunming, Yunnan,650032,China;Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine of Kunming,Kunming,Yunnan,650032,China

[Abstract]Objective To prepare the cryopreserved umbilical cord mesenchymal stem cells(UC-MSCs)into a kind of preparation that can be directly clinically used upon the resuscitation and to test the quality.MethodsThe cryopreserved UC-MSCs from the seed cell bank were resuscitated and collected when cultivated to P3-generation.The cell protective fluid containing 5% human serum albumin (HSA),10%DMSO and 85%compound electrolyte solution with a specification of 4×107/agent was added to form the preparation,the quality of which was tested,including sterility test,mycoplasma detection,internal and external pathogenic factor detection,endotoxin detection,immune phenotype detection,stability detection,abnormal immune response detection and residue detection.ResultsThe UC-MSCs preparation thus prepared was sterile without mycoplasma contamination or internal and external pathogenic factors,with poison＜2 EU.It could inhibit the proliferation of allogeneic lymphocytes,with the inhibition ratio increasing with the increase of the number of UC-MSCs.Bovine serum residue＜50 ng/bag;the cell activity of the preparation before cryopreservation＞90%;the cell activity after the resuscitation＞85%.ConclusionThe UC-MSCs preparation thus prepared is up to the quality test standard for clinical treatment.

UC;MSC;preparation;quality test

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1365-05

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.004

2016-07-04)

國家科技支撐計劃項目（2014BI01B0）；國家973計劃項目（2012CB5181060）；云南省科技計劃重點項目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區昆明總醫院細胞生物治療中心，干細胞與免疫細胞生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室,云南省細胞治療技術轉化醫學重點實驗室，云南省干細胞工程實驗室，昆明市干細胞與再生醫學研究重點實驗室

龐榮清,E-mail:pangrq2000@aliyun.com；潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com