骨髓源性脂肪祖細胞培養及生物學特性研究

朱光旭，王金祥，周 芳，李自安，劉菊芬，阮光萍，白盈盈，潘興華

骨髓源性脂肪祖細胞培養及生物學特性研究

朱光旭，王金祥，周 芳，李自安，劉菊芬，阮光萍，白盈盈，潘興華

目的體外培養骨髓脂肪祖細胞（BMAPs），比較其與骨髓間充質干細胞（BMSCs）在形態、表型特征、成脂肪分化能力以及脂肪分化相關基因表達方面的差異。方法無菌取1～2月齡雄性SD大鼠的股骨和脛骨骨髓制作細胞懸液，EBM-2 (含20%FBS、15 μg/ml ECGs)培養基差速貼壁法培養第3次貼壁細胞，取傳代至第3～5代細胞用于實驗。流式細胞分析檢測CD34、CD44、CD45及CD90表達；STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit檢測細胞成脂肪分化能力；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time qPCR)檢測過氧化物酶體增殖激活受體γ（Ppaγ）、脂肪酸結合蛋白4（Fabp4）、脂蛋白脂肪酶（Lpl)、CCAAT/增強子結合蛋白α（Cebpa）、葡萄糖轉運蛋白4（Slc2a4）及前脂肪細胞因子1（pread1）mRNA表達水平。結果傳代接種培養24 h后，BMSCs形態上呈寬大、扁平狀，而BMAPs大部呈長三角狀；接種48 h后，BMSCs排列更為有序，而BMAPs多交織成網狀。BMAP表達CD34、CD44、CD45及CD90，BMSC表達CD44及CD90，未檢測到CD34和CD45表達。誘導培養后第4 d，BMAPs成脂率顯著高于BMSCs（P＜0.01）；到第8 d，BMAPs成脂率為（87.2±11.67）%，BMSCs成脂率為（18.5±10.2）%，差異具有統計學意義（P＜0.01）。誘導分化后第4、8 d，Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和Slc2a4 mRNA在BMAPs表達水平均顯著高于BMSCs（P＜0.01）。結論本實驗獲得了1種具有干細胞的生物學特性，高表達脂肪分化相關的特異性基因，可高效均質性地分化為脂肪細胞的BMAPs。

骨髓；脂肪祖細胞；間充質干細胞；脂肪細胞；分化

骨質疏松癥患者往往伴隨了骨髓肥胖，而骨髓脂肪細胞的生成造成的骨髓脂肪堆積是促進骨髓疏松癥發病進程的關鍵[1]。骨髓間充質干細胞（BMSCs）可以向脂肪細胞分化，但其成脂肪分化能力并不一致。文獻報道，人原代培養的BMSC在體外誘導時，絕大部分細胞并不能分化為脂肪細胞[2]，因此，骨髓內可能存在其他具有脂肪細胞分化潛能的細胞。在正常骨髓，隨著年齡的增長，相當一部分紅骨髓會被黃骨髓取代，而黃骨髓內主要包含大量脂肪細胞，因此，研究骨髓脂肪堆積和骨髓細胞脂肪分化及其機制有重要的潛在醫學價值。骨髓內主要包含造血干細胞和基質細胞兩種類型的干細胞[3]，二者均具有多向分化潛能，造血干細胞在適當培養條件下可被誘導分化為內皮祖細胞[4]，骨髓內干細胞是否也可以被誘導培養分化為脂肪祖細胞(BMAPs)，未見研究報道。本實驗應用內皮基礎培養基-2（EBM-2）聯合內皮生長因子添加劑（ECGs），在含20%胎牛血清條件下，差速貼壁法去除BMSCs與其他類型單個核細胞后，培養出一類具備較強的成脂肪分化能力和一定成骨分化能力的細胞。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 1～2月齡雄性SD大鼠由昆明醫科大學實驗動物中心提供，動物實驗經倫理委員會批準。DMEM/F12干粉培養基（Hyclone公司），優質胎牛血清 （FBS，PAA公司），GoScript反轉錄系統、逆轉錄聚合酶鏈式反應 （RT-PCR）marker、GoTaqqPCRMaster M iX（Progema公司），STEMPROOsteogenesis Differentiation Kit(Gibco)，STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit(Gibco)，內皮基礎培養基-2（EBM-2，Lonza），內皮生長因子添加劑（ECGs, Millipore），PE-抗大鼠CD34(abcam)，FITC-抗大鼠CD45(ebioscience)，PE-抗大鼠 CD44(ebioscience)，FITC-抗大鼠CD90 (ebioscience)，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma)，實時定量PCR儀以及凝膠掃描儀（Bio-RAD）,FT-6000酶標儀(RAYTO公司)，流式細胞分析儀(FACScan,Becton Dickinson)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 脫臼處死SD大鼠，無菌取股骨和脛骨,PBS沖洗骨髓入無菌培養皿，輕輕吹打使細胞分散，將細胞懸液轉移到離心管，靜置8～10 min，使組織塊沉降到管底，轉移細胞懸液到另一離心管，1500 r/m離心5 min棄上清，以EBM-2(含20%FBS、15 μg/ml ECGs及青、鏈霉素各100 U/ml)培養基小心吹打混勻，以1×107/cm2接種于培養瓶，37℃、5%CO2條件下培養。24 h后棄貼壁細胞，轉移細胞懸液到另一培養瓶，再次孵育24 h后棄貼壁細胞，轉移細胞懸液到另一新培養瓶繼續培養；48 h后再次棄懸浮細胞，對第3次貼壁細胞進行培養，以后每4 d換一次液，待細胞鋪滿瓶底約80%～90%后，進行傳代培養，取第3～5代細胞用于實驗。

1.2.2 流式細胞分析 取P4細胞制作細胞懸液，取3×105細胞與含1～2%的牛血清白蛋白和0.1%疊氮鈉的冷PBS稀釋的相應抗體在4℃孵育45 min，以PBS或同型抗體為對照，孵育完畢后加入冷PBS 1 ml，離心洗滌2次，以除去未結合的多余抗體成分。加入冷PBS 500 μl，吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存、待測。對非直接熒光標記抗體，用含1%～2%的牛血清白蛋白和0.1%疊氮鈉的冷PBS稀釋第1抗體，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1.5 h；離心棄上清，加入含1%～2%的牛血清白蛋白和0.1%疊氮鈉的冷PBS稀釋第2抗體，4℃或置冰上孵育避光30 min；將細胞重新懸浮于500 μl PBS中混勻，置流式管中，4℃冰箱避光保存，流式細胞分析儀進行檢測。

1.2.3 成脂、成骨分化實驗 成脂誘導：消化收集P4代細胞，按照1×104個/cm2接種到12孔板中靜置培養，至細胞100%甚至是過度融合時，棄培養液，加入成脂分化誘導液培養，每隔3 d換液。誘導培養14 d后，用4%多聚甲醛固定細胞，進行油紅O染色。采用DAPI標記細胞核，檢測DAPI陽性細胞數，同一視野下觀察脂肪細胞分布及數量，計算公式為：脂肪細胞百分率=（油紅O染色陽性細胞數÷細胞總數)×100%。成骨誘導：將P4代細胞按照5× 103/cm2接種到12孔板中靜置培養，至細胞60%融合狀態時，棄培養液，加入成骨誘導液連續培養，每隔3 d換液，培養21 d后，用4%多聚甲醛固定細胞，加入茜素紅進行染色。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測基因表達 按照GoScript反轉錄試劑說明，取細胞進行mRNA提取并進行反轉錄，獲得cDNA。所獲得的cDNA用GoTaqqPCRMaster MiX，按照操作說明進行實時定量PCR測定。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作內參照。反應條件為50℃2 min，95℃變性10 min→95℃15 s→55℃退火1 min→72℃延伸30 s,循環次數35次，溶解曲線65～55℃，增量0.5℃5 s。反應結束后各取PCR產物4 μl，進行1.7%瓊脂糖電泳，用Gel Doc 2000凝膠圖像掃描儀分析。所需PCR引物應用Primer3web version 4.0.0（http://primer3.ut.ee/）設計（表1）。

表1 實時定量聚合酶鏈式反應引物

2 結果

2.1 培養細胞的生長特征與成骨及成脂肪分化

由于BMSCs同樣具有成脂肪分化能力，因此以BMSCs為對比進行分析。接種后24 h，BMSCs形態上呈寬大、扁平狀(圖1D），第三次貼壁細胞(BMAPs)大部呈三角狀 (圖1A)；接種后培養48 h，相較于BMAPs，BMSCs排列更為有序(圖1E)，前者多交織成網狀(圖1B)；在融合生長期，BMSCs的有序排列狀況(圖1F)較BMAPs(圖1C)更為明顯，呈漩渦式生長。成骨分化實驗表明，BMSCs和BMAPs均能夠被誘導向成骨細胞（圖1G和H）和脂肪細胞(圖1I和J）分化。

2.2 BMAPs和BMSCs的表面標志表達 流式細胞分析表明BMAPs表達CD34、CD44、CD45及CD90等表面標志，其中CD34表達率為（86.6±6.7）%，CD44表達率為 （92.1±7.9）%，CD45表達率為 （88.4±3.6）%，CD90表達率為（81.3±7.8）%。BMSCs主要表達CD44以及CD90，未檢測到CD34和CD45表達，其中CD44表達率為（88.1±3.1）%，CD90表達率為（73.4±6.2）%。見圖2。

2.3 BMAPs與BMSCs脂肪細胞分化能力的比較

BMAPs與BMSCs均可以被誘導分化為脂肪細胞，但是二者向脂肪細胞分化能力有顯著區別（圖3）。誘導培養后第4、8 d，BMAPs成脂率為（47.6±4.7）%，顯著高于BMSCs組的（4.4±3.2）%（P＜0.01）；到第8 d，BMAPs成脂率為（87.2±11.67）%，同樣顯著高于BMSCs組的（18.5±10.2）%（P＜0.01）。見圖3。

2.4 脂肪相關基因在BMAPs與BMSCs成脂肪分化誘導中的表達變化 Ppaγ、Fabp4、Lpl、Cebpa、Slc2a4及 pread1等 6種脂肪分化標志基因在BMAPs呈不同程度表達 （圖4A），real-time PCR檢測結果表明，除了 pread1外，Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和Slc2a4總體上在BMSCs和BMAPs的表達，均隨脂肪誘導分化而升高，而pread1隨脂肪誘導分化而降低；到誘導分化后第4、8 d，Cebpa、Fabp4、Lp1、Ppaγ和 Slc2a4在BMAPs表達均顯著高于在BMSCs的表達（P＜0.01），即使在未進行誘導分化前，Cebpa、Ppaγ和Fabp4、特別是Fabp4在BMAPs的表達也顯著高于在BMSCs表達（P＜0.01）。

3 討論

新近研究證實，骨髓來源干細胞參與了哺乳動物的脂肪生成[6]，骨髓可以被看作為BMAPs的儲存庫[6]，但骨髓內是否存在BMAPs的研究較少。BMSCs已被證實可以向脂肪細胞分化，但人原代培養BMSCs在體外誘導時絕大部分細胞并不能分化為脂肪細胞[2]，因此，很難把BMSCs等同于BMAPs。Lu等[5]應用免疫磁珠從 BMSCs分離獲得的 Sca-1+、CD73-、CD90-、CD105+細胞亞群具有極強的成脂肪分化能力，且命名為BMAPs，但該亞群細胞僅占BMSCs微小部分。

本實驗應用EBM-2培養基聯合ECGs，在含20%FBS條件下，培養第三次貼壁的骨髓單個核細胞，理論上排除了BMSCs和其他類型單個核細胞污染。與BMSCs比較，培養細胞形態上略有區別，接種培養24 h后，該細胞大部分呈三角狀，而BMSCs呈寬大、扁平狀。培養48 h后，BMSCs排列更為有序，前者多交織成網狀；在融合生長期，BMSCs的有序排列狀況更為明顯，呈漩渦式生長。成骨分化實驗表明，二者均具有向成骨細胞分化能力，但誘導培養后第4 d，該細胞成脂率顯著高于BMSCs組，到第8 d該細胞成脂率高達為（87.2±11.67）%，而BMSCs組僅為（18.5±10.2）%。由于具有極高的成脂肪細胞分化能力，并且具有干細胞多向分化特性，表明該細胞具有BMAPs屬性。

圖1 培養BMAPs和BMSCs的生長特征及成骨、成脂分化

圖2 BMAPs和BMSCs的表型分析結果

圖3 BMAPs與BMSCs向脂肪細胞分化能力

圖4 脂肪相關基因在BMAPs和BMSCS成脂分化過程中的表達變化

流式細胞分析表明，BMAPs表達CD34、CD44、CD45以及CD90等表面標志，其中CD34表達率高達為（86.6±6.7）%。在骨髓，CD34是HSCs的主要標志，表明該細胞應由HSCs分化而來；CD45表達率為（88.4±3.6）%。BMSCs主要表達CD44以及CD90，未檢測到CD34和CD45表達。Ppaγ[7-8]、Cebpa和Fabp4[5,9]以及Slc2a4[10]是脂肪分化相關特異性轉錄因子，在脂肪生成的調節中起關鍵作用。Ppaγ、Cebpa和Fabp4在脂肪分化早期即有表達,且它還可調控其他脂肪細胞特異性基因的表達,從而調控成脂肪分化。通過RT-PCR技術檢測這些相關基因的表達，結果表明包括 pread1、Ppaγ、Cebpa和Fabp4，在BMAPs表達的水平均顯著高于在BMSCs表達；Ppaγ、Cebpa、Fabp4、Lp1和 Slc2a4均隨細胞脂肪分化而顯著上升，BMAPs各組的表達水平均顯著高于在BMSCs表達，而pread1則隨成脂肪細胞誘導分化而顯著降低，特別是誘導后第8 d，pread1在BMAPs表達水平顯著低于其在BMSCs的表達。

本實驗所獲得的細胞具有成骨和成脂肪分化潛力，具有干細胞的生物學特性，同時高表達脂肪分化相關的特異性基因，可高效均質性地分化為脂肪細胞，可定義為BMAPs，結果為肥胖以及脂肪組織增生的研究提供了新的理論基礎和細胞模型。

[1] Rosen CJ,Ackert-Bicknel C,Rodriguez JP,et al.Marrow fat and the bone microenvironment:developmental,functional,and pathological implications[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr,2009, 19(2):109-124.

[2] Russel KC,DG Phinney,MR Lacey,et al.In vitro high capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitmen[J].Stem Cells,2010,28:788-798.

[3] Oswald J,Boxberger S,Jθrgensen B,et al.Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro[J].Stem Cells,2004,22(3):377-384.

[4] Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997, 275(5302):964-967.

[5] Lu Q,Liu H,Cao T.Efficient isolation of bone marrow adipocyte progenitors by silica microbeads incubation[J].Stem Cells Dev, 2013,22(18):2520-2531.

[6] Rydén M,Uzunel M,H?rd JL,et al.Transplanted bone marrow-derived cells contribute to human adipogenesis[J].Cell Metab,2015,22(3):408-417.

[7] 張艷,劉友學.脂肪細胞分化過程中的分子事件 [J].兒科藥學雜志,2008,14(1):56-57.

[8] 高宇，余慶雄，李青峰.脂肪干細胞體外誘導分化的研究進展[J].組織工程與重建外科雜志,2014,10(2):106-108.

[9] Gao Y,Sun Y,Duan K,et al.CpG site DNA methylation of the CCAAT/enhancer-binding protein,alpha promoter in chicken lines divergently selected for fatness[J].Anim Genet,2015,46(4): 410-417.

[10] Lee N,Kim I,Park S,et al.Creatine inhibits adipogenesis by downregulating insulin-induced activation of the phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway[J].Stem Cells Dev,2015,24(8):983-994.

Study on culture and biological characteristics of BMAPCs

Zhu Guangxu1,Wang Jinxiang1,Zhou Fang1,2,Li Zi'an1,Liu Jufen1,Ruan Guangping1,Bai Yingying1,2,Pan Xinghua11.Cell Biological Therapy Center,Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming,Yunnan,650032,China;National Joint Engineering Laboratory of Stem Cells and Immune Cells and Biological Medicine Technology,Kunming,Yunnan,650032, China;Key Laboratory of Cell Therapy Technology and Translational Medicine of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032, China;2.Clinical College of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command,Kunming Medical University,Kunming, Yunnan,650032,China

Objective To explore the difference in morphology,phenotypic characteristics,capacity to differentiate into fat cells and expressions of genes relevant to differentiation into fat cells between bone marrow adipocyte progenitor cells(BMAPCs)and bone mesenchymal stem cells(BMSCs).MethodsThe femoral and tibial bone marrow of male SD rats aged one to two months was sampled in a sterile manner to prepare cell suspension.The third adherent cells were cultivated by differential adhesion method in EBM-2 (containing 20%FBS,15 μg/m l ECGs)culture media.Passage three(P3)-passage five(P5)of the third adherent cells were used in the experiments.The expressions of CD34,CD44,CD45 and CD90 were detected by flow cytometry;the capacity of cells to differentiate into fat cells was detected by STEMPROAdipogenesis Differentiation Kit.The levels of Ppaγ,Fabp4,Lpl,CCAAT/enhancer binding protein α(Cebpa),glucose transporter(GLUT)4(Slc2a4)and pread1 mRNA were detected by real-time qPCR.Results24 hours after the passage inoculation culture,BMSCs were wide and flat in morphology,while the most of BMAPCs were in long triangle shape.48 hours after the inoculation,the arrangement of BMSCs was more orderly,while most BMAPCs were interwoven into a network.BMAPCs expressed CD34,CD44,CD45 and CD90;BMSCs expressed CD44 and CD90,CD34 and CD45 were not expressed.On the fourth day after the induction culture,the fat cell percentage of BMAPCs was significantly higher than that of BMSCs(P＜0.01);on the eighth day,the fat cell percentage of BMAPCs was(87.2±11.67)%,while that of BMSCs was(18.5±10.2)%, showing a more significantly difference(P＜0.01).On the fourth and eighth day after the induction differentiation,the levels of Cebpa, Fabp4,Lp1,Ppaγ and Slc2a4 mRNA in BMAPCs were significantly higher than those in BMSCs(P＜0.01).ConclusionOne kind of BMAPCs which have the biological characteristics of stem cells and high levels of distinctive genes relevant to differentiation into fat cells and can be effectively and homogenously differentiated into fat cells are obtained in the experiment.

BMAPC;MSC;fat cell;differentiation

R 318.1

A

1004-0188（2016）12-1386-06

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.010

2016-07-04）

國家科技支撐計劃項目（2014BI01B00）；國家自然科學基金（81170316）；云南省科技計劃項目（20111HB050，2013DA004）

650032昆明，成都軍區昆明總醫院細胞生物治療中心,干細胞與免疫細胞生物醫藥技術國家地方聯合實驗室，云南省細胞治療技術轉化醫學重點實驗室（朱光旭，王金祥，周 芳，李自安，劉菊芬，阮光萍，白盈盈，潘興華）；昆明醫科大學成都軍區昆明總醫院臨床學院（周 芳，白盈盈）

潘興華:E-mail:panxinghua@aliyun.com