人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化制備技術(shù)研究

趙 晶，何 潔，王金祥，蔡學(xué)敏，龐榮清，潘興華

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化制備技術(shù)研究

趙 晶，何 潔，王金祥，蔡學(xué)敏，龐榮清，潘興華

目的建立人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；苽浼夹g(shù)。方法在無(wú)菌條件下，采集剖腹產(chǎn)嬰兒臍帶30條，長(zhǎng)40～50 cm，棄被膜、血管后，剪成1 mm3的組織塊，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行組織塊反復(fù)貼壁培養(yǎng)，采用倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)及形態(tài)，對(duì)傳代培養(yǎng)的第3代細(xì)胞采用流式細(xì)胞分析法進(jìn)行細(xì)胞周期及表形分析，采用體外定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)觀察多向分化潛能。結(jié)果組織塊貼壁后于第4 d開始向周圍呈放射狀長(zhǎng)出細(xì)胞，平均12 d左右長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞形態(tài)呈均一梭形；傳代培養(yǎng)后生長(zhǎng)快速，于4～5 d達(dá)80%融合；連續(xù)傳代3次，其生長(zhǎng)特性和形態(tài)不變，CD90、CD29陽(yáng)性率＞99%，CD105陽(yáng)性率＞81%，不表達(dá)CD34，CD45，在體外能分化成骨、軟骨、脂肪細(xì)胞。平均每條臍帶獲得細(xì)胞數(shù)＞6×109個(gè)。結(jié)論通過(guò)多條人臍帶重復(fù)分離培養(yǎng)，建立了體外規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備與鑒定技術(shù)規(guī)范及標(biāo)準(zhǔn)，可為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)建設(shè)和臨床應(yīng)用提供技術(shù)支持和標(biāo)準(zhǔn)化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

臍帶；間充質(zhì)干細(xì)胞；制備；鑒定，規(guī)?；?；標(biāo)準(zhǔn)化

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是一類來(lái)源于新生兒臍帶組織的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，具有向神經(jīng)、血管、肌肉、骨、軟骨、脂肪等多種功能細(xì)胞分化的潛能[1-6]。該類細(xì)胞的特點(diǎn)是[4-5]：（1）來(lái)源豐富、取材方便；（2）增殖能力強(qiáng)，易于體外規(guī)?；苽洌瑯?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和儲(chǔ)存；（3）免疫原性低，異體或異種移植無(wú)明顯免疫排斥反應(yīng)，臨床應(yīng)用安全性可控；（3）可廣泛用于各種損傷、退變、自身免疫反應(yīng)等疾病治療；（4）比其他來(lái)源的干細(xì)胞更具有產(chǎn)業(yè)化和臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。目前，不同實(shí)驗(yàn)室的hUC-MSCs制備方法和結(jié)果有一定差異，缺乏統(tǒng)一的技術(shù)操作標(biāo)準(zhǔn)，從而導(dǎo)致培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞質(zhì)量不盡相同，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療結(jié)果有一定差異。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)建立了組織塊多次貼壁法高效制備hUC-MSCs的技術(shù)，本研究在此基礎(chǔ)上，通過(guò)重復(fù)和優(yōu)化技術(shù)操作，進(jìn)一步規(guī)范了技術(shù)操作流程和方法，為建立 hUC-MSCs庫(kù)，研發(fā)hUC-MSCs的臨床制劑及轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臍帶來(lái)源 新生兒臍帶采自本地區(qū)三甲醫(yī)院或省級(jí)婦幼保健醫(yī)院，采集前進(jìn)行圍產(chǎn)期孕婦血標(biāo)本的乙型肝炎病毒DNA、丙型肝炎病毒DNA、人類免疫缺陷病毒、梅毒螺旋體抗體、巨細(xì)胞病毒，支原體檢測(cè)，均為陰性。同時(shí)留樣4℃儲(chǔ)存2個(gè)月后復(fù)檢，排除潛伏攜帶病原。產(chǎn)前影像學(xué)和遺傳代謝性疾病篩查，胎兒發(fā)育良好，無(wú)先天性畸形。采集臍帶長(zhǎng)度40～50 cm，采集后立即轉(zhuǎn)送到細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室。采集臍帶前，均告知產(chǎn)婦，征得家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 主要設(shè)備和試劑 DMEM/F12培養(yǎng)液（Hyclone），胎牛血清（FBS）和 0.25%trypsin-ETDA（BI公司），流式細(xì)胞儀（FACSCalibur,BD公司），流式抗體（Beckma），成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)試劑盒（GIBCO公司）。

1.3 UC-MSC分離和培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下，將采集的新鮮剖腹產(chǎn)足月胎兒的臍帶放入無(wú)菌50 ml的離心管中，于1 h內(nèi)送至細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室。在無(wú)菌條件下，用生理鹽水反復(fù)沖洗，去掉殘留血漬、被膜和血管；用含有雙抗的PBS液浸泡2～3 min后，將臍帶剪碎成1 cm長(zhǎng)，然后分裝于EP管內(nèi)，用眼科剪將組織塊剪成1 mm3左右，洗滌后再對(duì)應(yīng)移至到175 cm2培養(yǎng)瓶中，加入7～8 ml的10%FBS的DMEM/F12，搖晃后使組織塊均勻分布，再將培養(yǎng)瓶放于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，3～4 d換液。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞從組織塊周圍爬出且生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用0.25%trypsin-EDTA消化，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)至第3代，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)存活率后凍存。

1.4 細(xì)胞表型分析 采用第3代細(xì)胞，用0.9%生理鹽水洗滌反復(fù)離心3次，分成含1×106個(gè)細(xì)胞/管，加入 10 μl抗 CD90-FITC、CD105-PE、CD-29FITC、CD34-PE、CD45-PC5，避光孵育30 min，磷酸鹽緩沖液洗滌后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行相關(guān)表型分析。

1.5 細(xì)胞分化潛能檢測(cè)

1.5.1 成脂誘導(dǎo)分化 取P3生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，按1×104個(gè)/cm2接種到12孔板中，放置5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每隔3 d換液一次，至細(xì)胞100%融合時(shí)，去除上清，用生理鹽水換洗2次，加人成脂誘導(dǎo)分化試劑培養(yǎng)，每隔3 d換液一次，培養(yǎng)14～21 d后，采用多聚甲醛固定，油紅O染色觀察。

1.5.2 成骨誘導(dǎo) 用第3代細(xì)胞按5×103/cm2接種到6孔板中，放置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔3 d換液一次，至細(xì)胞60%融合時(shí)，去除上清，用生理鹽水換洗2次，加人成骨分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)（GIBCO，美國(guó)，成骨誘導(dǎo)試劑盒）；每3 d換一次液，培養(yǎng)至第21 d，用4%多聚甲醛固定，茜素紅染色5～10 min，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 成軟骨誘導(dǎo)分化 利用第3代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，吸取5 μl接種到6孔板中，放置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，加入2 ml成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，每3 d換液1次；培養(yǎng)第14 d，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，阿新藍(lán)染色，顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 UC-MSCs的生長(zhǎng)及形態(tài) 組織塊貼壁法原帶在4～6 d時(shí)，可見組織快周圍有纖維樣細(xì)胞呈放射狀爬出，呈菱形、星形或多邊形等(圖1A)；12～15 d可見大量克隆狀細(xì)胞生長(zhǎng)（圖1B），細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%～90%。按1∶3的比例消化傳代后，傳代4 d可見纖維樣細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁，呈菱形旋窩狀，增殖速度快，活性好，形態(tài)均一。

圖1 體外培養(yǎng)的UC-MSCs

2.2 UC-MSCs的表型 對(duì)P3代細(xì)胞進(jìn)行免疫抗原表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果顯示，CD90和CD29表達(dá)率＞99%，CD105表達(dá)率為80%，CD34表達(dá)率低于1%，符合UC-MSCs表型標(biāo)準(zhǔn)。見圖2。

圖2 第3代hUC-MSCs表型

2.3 UC-MSC的分化潛能 成脂分化：P3細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化14～21 d后，可見胞漿內(nèi)充滿脂滴3；成骨分化：P3細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化21 d，可見紅色的鈣質(zhì)結(jié)節(jié)3；成軟骨分化：P3成軟骨誘導(dǎo)分化14～28 d后，可見藍(lán)色的軟骨膠原基質(zhì)3。見圖3。

圖3 UC-MSC的誘導(dǎo)分化結(jié)果

2.4 hUC-MSCs的獲得量 本組實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)組織塊反復(fù)3次培養(yǎng)并傳代3次，每條臍帶獲得的第3代臍帶間充數(shù)量≥6×109個(gè)，可滿足臨床100例次治療用；若傳代到第5代，可滿足900例次使用。按此方法繼續(xù)傳代，預(yù)計(jì)每條臍帶可制備出滿足上千例次使用的標(biāo)準(zhǔn)化臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

3 討論

鑒于hUC-MSCs的多向分化潛能和強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能[6]，預(yù)計(jì)將在各種損傷、退變、中毒和自身免疫性疾病治療中發(fā)揮重要作用，特別是對(duì)放射傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷修復(fù)治療具有特別重要的軍事醫(yī)學(xué)價(jià)值。涉及hUC-MSCs的臨床應(yīng)用，首先必須獲得足夠數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞。本研究組經(jīng)過(guò)多年摸索，建立了一套高效、規(guī)?；苽鋒UC-MSCs的技術(shù)方法，在本研究的基礎(chǔ)上，完成了治療多種疾病的療效與安全性評(píng)價(jià)及機(jī)制研究，并建立了種子細(xì)胞庫(kù)，初步解決了臨床前關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。

與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道相比，本研究的結(jié)果更具有系統(tǒng)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，可作為體外高效、規(guī)?；苽錁?biāo)準(zhǔn)化hUC-MSCs的參考方法，也可為建立干細(xì)胞庫(kù)提供技術(shù)支撐。本課題參照Bruyn和本研究組前期建立的方法，進(jìn)一步改進(jìn)和完善了多次貼壁法高效制備hUC-MSCs的方法，建立了組織塊多次貼壁制備hUC-MSCs的方法，獲得率更高，結(jié)果更穩(wěn)定、可靠。經(jīng)過(guò)免疫表達(dá)和誘導(dǎo)分化檢測(cè)，均符合間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)和國(guó)際細(xì)胞學(xué)會(huì)制訂的間充質(zhì)干細(xì)胞評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，與國(guó)家衛(wèi)計(jì)委和國(guó)家食品監(jiān)督管理局于2015年8月聯(lián)合發(fā)布了《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》的要求一致。

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國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BI01B0）；國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB5181060）；云南省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2013CA005）

650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

潘興華，E-mail:xinghuapan@aliyun.com