血痛定噴霧劑的制備及體外凝血作用的研究

侯 君，鄭德志，李聃丹，于波濤，呼永河

·論著·

血痛定噴霧劑的制備及體外凝血作用的研究

侯 君，鄭德志，李聃丹，于波濤，呼永河

目的制備中藥血痛定噴霧劑，并考察其對體外凝血指標的影響。方法通過高分子材料PCEC合成、制備可同時傳輸疏水性（獨一味、祖師麻）和親水性藥物（三七）的高效透皮給藥的中藥外用噴霧劑——血痛定噴霧劑。結果制備的血痛定噴霧劑納米粒呈圓形顆粒狀分布，峰形單一，平均粒徑32.86 nm，帶負電荷，電位-1.79 mV。隨著噴霧劑濃度的增加，體外凝血酶時間、部分激活的凝血酶時間降低，凝血酶原時間呈不規律性變化，纖維蛋白原呈先遞減后遞增的趨勢。結論成功制備血痛定噴霧劑，明確其對體外凝血指標的止血作用。

血痛定；噴霧劑；PCEC；高效透皮傳輸給藥系統

血痛定組方包含三七、獨一味、祖師麻等，其中三七，味甘、微苦，性溫，功能散瘀止血，用于外傷出血，跌撲腫痛[1]。獨一味，甘、苦，性平，功能活血止血，主用于跌打損傷，外傷出血[2]。上二藥配伍，活血止血，化瘀定痛，針對“筋傷”病機血不循經，瘀血阻滯病機。祖師麻，辛苦，溫，功能祛風濕、散瘀、止痛，針對“筋傷”外風入絡，以助君藥祛風化瘀止痛[3]。因此，血痛定具有較好的止血作用。本研究擬采用高分子材料合成、制備可同時傳輸疏水性和親水性藥物的高效透皮緩釋給藥系統，促進血痛定中有效成分的透皮吸收、傳輸，制備具有快速、高效止血作用的中藥外用噴霧劑。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 己內酯、PEG4000、辛酸亞錫等購于國藥集團；三七、獨一味、祖師麻提取物由本實驗室制備。Varian 400型核磁共振氫譜（美國Varian公司）；X’Pert Pro型 X-射線衍射儀 (荷蘭Philips公司)；APV 2000型高壓勻質機（德國APV公司）；MDF382E型超低溫冰箱（日本sanyo公司）；Zetasizer 3000型粒度與電勢分析儀(英國Malvern公司)；tec-10型透射電子顯微鏡(荷蘭Philips公司)；CA510型全自動血凝儀（日本sysmex公司）。

1.2 實驗動物 家兔購于四川大學實驗動物中心（許可證號：川實動管字第71號）。

1.3 血痛定噴霧劑的制備

1.3.1 聚己內酯-聚乙二醇-聚己內酯（PCL-PEGPCL）共聚物PCEC的合成[4]按比例將己內酯、PEG4000及辛酸亞錫（0.5%w/w，辛酸亞錫所加的量為PEG2000的0.5%）加入到三口燒瓶中。通過機械攪拌和氮氣保護，在130℃油浴中反應6 h，溫度升到180℃并抽至真空。20 min后終止反應，待溫度降到室溫后，用二氯甲烷溶解聚合物，然后將其倒入冷石油醚中沉淀，過濾，在通風櫥中使溶劑揮發，真空干燥備用。

1.3.2 PCEC的表征鑒定 （1）分子結構鑒定：核磁共振氫譜1H-NMR表征PCEC分子結構，聚合物被溶解到CDCl3。（2）結晶性能鑒定：X-射線衍射XRD表征聚合物材料的結晶性能，Cu Kα作靶。

1.3.3 載藥納米粒制備 將獨一味、祖師麻提取物與PCEC溶于乙酸乙酯中，然后加入三七提取物的水溶液（濃度為1 g/ml），3藥提取物皆占PCEC質量的1%，PCEC的用量為乙酸乙酯質量的5%。高速勻漿機乳化，轉速10 000 r/min，形成油包水的乳液；加入含50 ng/ml泊洛莎姆的水溶液中，再乳化，形成水包油包水的復乳。旋轉蒸發儀40℃減壓蒸發20 min，使乙酸乙酯揮發，即得載藥納米粒。

1.3.4 載藥納米粒質量控制 （1）粒徑分布測定：測試溫度為25℃，重復測試3次，取平均值。（2）ζ電位測定：測試溫度為25℃，重復3測試次，取平均值。（3）形貌分析：膠束用蒸餾水稀釋，滴到銅網上，磷鎢酸負染，室溫下干燥后透射電鏡觀察。

1.4 血痛定噴霧劑止血作用研究[5]

1.4.1 溶液配制

1.4.1.1 樣品溶液配制 精密稱定凍干血痛定噴霧劑粉末0.2 g，定容至100 ml容量瓶中，配制成為2 mg/ml的儲備液，臨用前稀釋成0.01～0.2 mg/ml溶液。

1.4.1.2 陽性對照藥物溶液的配置 精密稱取云南白藥粉0.3 g，定容至100ml容量瓶中，配制成為3 mg/ml儲備液，臨用前配制成為 0.15 mg/ml的陽性對照溶液。

1.4.2 血漿制備 健康家兔，雄性，體重2.5～3.0 kg，采血前24 h禁食，自由飲水。耳緣靜脈取血，3500 r/min離心10 min，收集上清，在-18℃冰箱保存。

1.4.3 血痛定噴霧劑對凝血酶時間（TT）的影響吸取血漿、蒸餾水，各濃度的血痛定溶液及云南白藥陽性對照各30 μl至比色杯，預熱2 min，吸取30 μl的TT試劑至該比色杯，每組平行測定3份。

1.4.4 血痛定噴霧劑對凝血酶原時間（PT）的影響

吸取血漿、蒸餾水，各濃度的血痛定溶液及云南白藥陽性對照各30 μl至比色杯，預熱2 min，吸取30 μl的PT試劑至該比色杯，每組平行測定3份。

1.4.5 血痛定對部分激活的凝血酶時間（APTT）的影響 吸取血漿、蒸餾水，各濃度的血痛定溶液及云南白藥陽性對照各30 μl至比色杯，預熱2 min，吸取30 μl的CaCl2試劑至該比色杯，每組平行測定3份。

1.4.6 血痛定對纖維蛋白原（FIB）的影響 吸取血漿、蒸餾水，各濃度的血痛定溶液及云南白藥陽性對照各40 μl至比色杯，預熱2 min，吸取20 μl的FIB試劑至該比色杯，每組平行測定3份。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血痛定噴霧劑的制備及質量表征

2.1.1 PCEC的質量表征 PEG的亞甲基特征峰值出現在3.65 ppm，4.18 ppm吸收峰則是PCL的-OCH2-CH2O-CO(CH2)5CO-的特征峰，說明PEG與PCL是由酯鍵相連的三嵌段共聚物（圖1）。圖2衍射峰單一而尖銳，說明PCEC的結晶性能良好。

圖1 核磁共振氫譜1H-NMR表征PCEC特征峰

圖2 X-射線衍射XRD表征PCEC結晶性能

2.1.2 血痛定噴霧劑的質量表征 圖3為載藥納米粒的透射電鏡圖，表明載藥納米直徑＜50 nm。圖4為載藥納米粒的粒徑分布圖，表明該納米粒的平均粒徑尺寸為32.86 nm，峰形單一說明載藥納米粒粒度分布均勻；圖5為載藥納米粒電位分析圖，所測得該納米粒的電位為-1.79 mV。

圖3 載藥納米粒的透射電鏡圖

圖4 載藥納米粒的粒徑分布

圖5 載藥納米粒的電位圖

2.2 血痛定噴霧劑止血作用評價

2.2.1 對TT的影響 隨著噴霧劑濃度增加，TT縮短，有利于快速止血，優于陽性對照組結果（表1）。

2.2.2 對PT的影響 隨著噴霧劑濃度增加，PT呈不規律性變化（表2）。

表2 各組血槳凝血酶原時間比較(n=4)

2.2.3 對APTT的影響 隨著噴霧劑濃度增加（0.08～0.15 mg/ml），APTT呈遞減趨勢，優于陽性組，但繼續增加噴霧劑濃度 （0.2 mg/ml），APTT反而增加（表3）。

2.2.4 對FIB的影響 隨著噴霧劑濃度增加，FIB呈先遞減后遞增的趨勢，陽性組優于噴霧劑組（表4）。

3 討論

本研究運用現代納米技術，對臨床驗方進行中藥有效成分或部位的研究與開發，避免了傳統中藥在加工過程中繁瑣的處理工序，使之形成納米中藥復方制劑，有利于藥物的規范化研究、開發、生產，大大提高了該制劑的現代化和標準化程度。血痛定噴霧劑是一種新型止血制劑，有效成分為PCLPEG-PCL共聚物。PCL是一種生物可降解、生物相容好的半結晶聚合物，它以微球、納米粒子和植入材料的形式在不同的藥物傳輸系統中得到了應用。由于PCL的高結晶度和強疏水性，使得PCL降解緩慢，并且疏水的PCL納米粒子在靜脈注射后會很快被網狀內皮系統清除。純PCL粒子在水中很不穩定，非常容易發生聚集。為了解決上述問題，課題組對PCL納米粒做了多種修飾，其中聚乙二醇（PEG）化的PCL納米結果最好。PEG化可使疏水性高分子納米粒具有兩親性，生物相容性提高，降解速度和藥物釋放行為可控，體內循環時間延長。這些特點使PEG化的PCL納米粒比純PCL納米粒在給藥系統中更有應用前景。

表1 各組血槳凝血酶時間比較（n=4）

表3 各組血槳部分激話的凝血酶時間比較(n=4)

表4 各組血槳纖維蛋白原比較(n=4)

凝血酶在止、凝血中發揮了重要的作用。PT值反映外源性凝血因子，APTT反映內源性凝血因子，TT值反映凝血共同途徑纖維蛋白原轉變為纖維蛋白的抗凝過程。本研究發現，血痛定噴霧劑不能縮短PT和FIB，但可以顯著縮短APTT和TT值。因此推測，血痛定噴霧劑體外止血作用可能是影響抗凝系統和內源性凝血因子起作用，而對外源性凝血因子和纖溶系統影響不大。

綜上所述，血痛定噴霧劑如能應用臨床，可作為外科手術的重要輔助工具，極具臨床應用前景。同時血痛定噴霧劑適合軍地兩用，具有極大的軍事和社會意義。

[1] 張子龍,王文全.三七本草研究概述[J].世界科學技術(中醫藥現代化),2010,12(2):271-276.

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[3] 李書慧,吳立軍,殷紅英.祖師麻化學和藥理活性研究進展[J].中國中藥雜志,2002,27(6):401-403.

[4] 黃安亮,成麗.新型靶向FAK基因shRNA的陽離子PCEC納米材料制劑對人乳腺癌增殖和凋亡的影響[J].華西藥學雜志, 2009,24(4):345-348.

[5] 向金,蓮程睿,張路晗.血竭的活血和止血作用研究[J].華西藥學雜志,2000,15(6):430-434.

Preparation and in vitro hemostatic effects of Xuetongding Spray

Hou Jun1,Zheng Dezhi2,Li Dandan3,Yu Botao1,Hu Yonghe41.Department of Pharmacy,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China;2.Department of Cardiovascular Surgery,General Hospital of Jinan Military Command, Jinan,Shandong,250031,China;3.Base for Drug Clinical Trail,Xinqiao Hospital Affiliated to Third Military Medical University, Chongqing,400037,China;4.Centre for High Humid Environment and Military Medicine,General Hospital of Chengdu Military Command,Chengdu,Sichuan,610083,China

Objective To prepare TCM Xuetongding Spray and observe its impacts on in vitro coagulation indexes.MethodsXuetongding Spray,the effective cutaneous TCM penetration for external use transmitting both hydrophobic drugs(Duyiwei and Zushima)and hydrophilic drugs (Sanqi)was synthetized and prepared with polymers PCEC.ResultsThe nanoparticles of Xuetongding Spray were round and uniform ly distributed,displayed a single peak.The average diameter was 32.86 nm,with negative charge and a potential of-1.79 mV.With the increase of spray concentration,the thrombin time in vitro and activated partial thrombin time decreased;the prothrombin time showed irregular changes;the fibrinogen decreased progressively first and then increased progressively.ConclusionXuetongding Spray is successfully prepared to identify its hemostatic effect in vitro.

Xuetongding Spray;PCEC;effective transdermal drug administration system

R 283

A

1004-0188（2016）12-1401-05

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.12.014

2016-07-22）

四川省科技廳科技支撐項目（2014SZ0037）；2014年度全軍后勤科研項目（BWS14J023）

610083成都，成都軍區總醫院藥劑科（侯 君，于波濤）,高濕環境軍事醫學研究中心（呼永河）;濟南軍區總醫院心血管外科（鄭德志）；第三軍醫大學新橋醫院臨床藥理基地（李聃丹）；

呼永河，電話：028-86570206；E-mail：huyonghezyy@163. com