李星月, 劉奇志, 李賀勤, 張林林, 張 鴻
(1.四川省農業科學院植物保護研究所 農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室, 四川 成都 610066; 2.中國農業大學農學與生物技術學院 昆蟲與線蟲實驗室, 北京 100193;3.青島農業大學農學與植物保護學院 山東省旱作農業技術重點實驗室, 山東 青島 266109;4.河北省農林科學院 昌黎果樹研究所, 河北 昌黎 066600)
土壤修復劑協同昆蟲病原線蟲對南方根結線蟲Meloidogyneincognita以及黃瓜幼苗生長的影響
李星月1,2, 劉奇志2 *, 李賀勤2,3, 張林林2,4, 張 鴻1
(1.四川省農業科學院植物保護研究所 農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室, 四川 成都 610066; 2.中國農業大學農學與生物技術學院 昆蟲與線蟲實驗室, 北京 100193;3.青島農業大學農學與植物保護學院 山東省旱作農業技術重點實驗室, 山東 青島 266109;4.河北省農林科學院 昌黎果樹研究所, 河北 昌黎 066600)
為了探究土壤修復劑SA協同昆蟲病原線蟲(Heterorhabditisbeicherriana)對南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)的室內抑制效果,以及二者結合施用對黃瓜生長的促進效果,本文以千秋1號為供試黃瓜品種,采用室內試驗方法,人工接種南方根結線蟲,并施入土壤修復劑SA和昆蟲病原線蟲,從實驗第7、14、21天時根結線蟲二齡幼蟲J2與H.beicherriana三齡幼蟲J3的存活率,實驗30 d時黃瓜幼苗的葉面積、株高、鮮重以及根結數幾個方面做了研究。結果表明:實驗第7、14、21天后,土壤修復劑SA和昆蟲病原線蟲處理組的根結線蟲(J2)存活數卻明顯低于根結線蟲清水對照組(M組),且第21天時SA處理組的死亡根結線蟲數量約是M組的2倍,加入昆蟲病原線蟲的處理組中死亡根結線蟲數量約是M組的3倍,然而昆蟲病原線蟲在SA處理組中的存活率卻明顯高于其他組。此外,土壤修復劑SA協同昆蟲病原線蟲加入到添加根結線蟲的黃瓜土壤中,可以增加黃瓜幼苗葉面積、鮮重、株高,并能減少單位長度內根結數量,說明土壤修復劑SA協同昆蟲病原線蟲的施用,提高了植株抵抗根結線蟲能力,減少了根結線蟲對根系危害,該結果為有效修復被根結線蟲污染土壤的研究提供理論基礎。
土壤修復劑; 昆蟲病原線蟲; 南方根結線蟲; 黃瓜; 根結數
根結線蟲(Meloidogynespp.)是一類世界性分布的,在經濟上極為重要的植物專性寄生線蟲,主要侵染作物根系,受害后的根系膨大形成根結,須根增多[1]。自從1855 年英國科學家Berkeley 在溫室黃瓜(CucumissativusL.)根系上發現能產生根結的植物線蟲以來,便開始了世界范圍內的防治根結線蟲的研究[3-4],在作物受害較輕時,地上部分通常無癥狀表現,受害較重時,癥狀表現為是矮化、黃化或萎蔫,類似于缺水缺肥[3]。近年來,我國保護地蔬菜發展迅速,溫室連年種植同種蔬菜作物,致使許多老齡溫室根結線蟲病害日趨嚴重,已造成了蔬菜的大幅度減產,給菜農們帶來了巨大的經濟損失[5-6]。
黃瓜根結線蟲病主要是由南方根結線蟲Meloidogyneincognita侵染引起,該蟲主要危害黃瓜的側根和須根,侵染的最初癥狀是在根表面形成典型的根結,根結的大小不一,淺黃色至黃褐色,由于根結的形成,造成植物根系運輸系統紊亂,耗損寄主營養,導致寄主營養和水分運輸能力的降低,最終植物產量下降,長勢衰弱[7-9]。根結線蟲對黃瓜所引起的產量損失,一般可大20 %~30 %,重者50 %以上[10],甚至發病率可達到90 %以上引起絕收[11]。目前,防治根結線蟲主要采用傳統的高毒、高殘留的有機磷和氨基甲酸酯類化學殺線劑,如涕滅威、苯線磷、硫環磷等,這些殺線劑不但污染環境,造成農殘,威脅人畜安全健康,而且易導致線蟲抗藥性的產生。因此,高效低毒、環境友好型的生物殺線劑的研發和應用顯得十分重要[12-15]。
國內外研究結果表明,昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic Nematode,簡稱EPN),作為專性昆蟲寄生性線蟲,還具有抑制植物線蟲的作用,尤其是它們的共生菌有抑制根結線蟲的現象[16-17]。此外,中國農業大學昆蟲與線蟲學實驗室研制了以昆蟲為生物發生器的、兼有藥效和肥料作用的土壤修復劑(Soil Amendment,簡稱SA)。并經過室內藥效評價與田間試驗結果,證明該土壤修復劑對南方根結線蟲具有抑制效果,并對其污染的土壤具有修復作用[18-19]。綜上所述,昆蟲病原線蟲和土壤修復劑SA分別都有抑制根結線蟲的作用,而且前期研究表明,SA不僅可以在一定程度上修復線蟲損傷的黃瓜根系[20],還可以促進黃瓜幼苗生長[6]。本文擬在前人研究的基礎上,探究土壤修復劑SA協同昆蟲病原線蟲對南方根結線蟲的室內抑制效果,并對二者結合使用對黃瓜生長的影響進行了評價,以期為修復被根結線蟲污染土壤的有效技術研究提供理論基礎。
1.1 實驗材料
供試植物:黃瓜,市售千秋一號(北京食根種業有限公司)。供試線蟲:南方根結線蟲(Meloidogyneincognita),異小桿線蟲Heterorhabditisbecherriana,實驗室保種擴繁。根結線蟲繁殖用土壤:花卉土∶沙子=1∶1;黃瓜水培營養液:參照王汝賢的方法配制;土壤修復劑SA:本實驗室專利產品。選擇儲藏14周的SA原液和蒸餾水配置稀釋125倍的SA溶液備用[5]。
1.2 實驗方法
1.2.1 南方根結線蟲二齡幼蟲的收集 將布滿根結線蟲卵塊的根剪碎,置于漂白劑溶液(5.25 % NaClO)中,用手輕柔搓洗碎根,使卵塊釋放單粒卵并懸浮于溶液中,用60、100、400目的網眼篩過濾分離,第3層(400目篩子)收集為干凈線蟲卵。再用蒸餾水沖洗干凈殘留在卵上的漂白劑,根結線蟲二齡幼蟲的收集采用貝曼漏斗法[20]。
1.2.2 SA協同昆蟲病原線蟲對南方根結線蟲的抑制作用 將10 mL的SA稀釋溶液加入直徑5.5 cm的小培養皿中,再加入約100條南方根結線蟲的二齡幼蟲(Second Juvenile,簡稱J2),在有EPN處理的小培養皿中加入約含50條H.beicherriana線蟲的三齡幼蟲(Second Juvenile,簡稱J3),清水對照處理用10 mL蒸餾水代替SA溶液,再分別在體視鏡下精確計數培養皿內的根結線蟲和EPN的條數。每個處理10個重復,本實驗重復3次。
將培養皿放入培養箱室溫(25 ℃)黑暗保存,分別于7、14、21 d后,在體視鏡下觀察并記錄根結線蟲J2與H.beicherriana線蟲J3的存活與死亡條數。
1.2.3 SA協同昆蟲病原線蟲對黃瓜幼苗生長的影響 黃瓜種子用40 ℃蒸餾水浸泡5 h后,取出放入培養皿中,并置入25 ℃培養箱中催芽1.5~2.0 d后,此時根長約5 mm。黃瓜催芽后,將50 mL水培營養液加入50 mL的三角瓶,將黃瓜幼苗置入三角瓶,葉片以上用薄膜固定。同時,按照試驗處理(表1),分別加入相應的數量的根結線蟲二齡幼蟲和EPN,以及SA溶液。最后,將栽種處理好的黃瓜幼苗放入人工氣候箱,培養條件:28 ℃、14 h光照和20 ℃、10 h黑暗、光強22 000 lx、相對濕度80 RH %,適時清水澆灌[20]。
1.2.4 黃瓜幼苗園藝性狀評價方法 在將黃瓜幼苗種入水培液中的第30天,取出黃瓜幼苗用于測定園藝性狀的各生理指標:鮮重、株高、葉面積,根長、根結數。小心從培養液中取出整株幼苗,用米尺測量逐一黃瓜幼苗的株高和根長,將植株從莖基部切斷,用分析電子天平分別測定總鮮重,同時統計根結數量,葉片總面積采用方格紙法進行測量[5, 21]。

表1 對黃瓜幼苗生長影響試驗處理
1.3 數據分析
不同處理組間的所有數據處理,運用Excel 2010統計分析軟件及數據處理軟件SPSS(Statistical Package for Social Sciences,SPSS 16.0)進行方差處理和顯著性分析。
2.1 根結線蟲二齡幼蟲J2與H. beicherriana 三齡幼蟲J3的存活率
根據圖1所示,實驗7 d后,與根結線蟲清水對照組(M)比較,3個處理組(M+H+SA,M+SA,M+H)的根結線蟲二齡幼蟲(J2)存活數和死亡數沒有顯著差別,而M組的根結線蟲(J2)死亡數卻明顯低于3個處理組(P<0.5)。實驗14 d后,3個處理組(M+H+SA,M+SA,M+H)的根結線蟲(J2)存活數量顯著低于M組,且根結線蟲(J2)死亡數均高于M組,M+SA處理組中的根結線蟲(J2)死亡數量低于其他2個處理組(M+H+SA,M+H)。到21 d時,3個處理組的根結線蟲(J2)存活數量顯著低于M組,而根結線蟲(J2)死亡數卻均高于M組, M+H+SA和M+SA組的死亡根結線蟲數量約是M組的2倍,M+H的死亡根結線蟲數量約是M組的3倍(圖 1B)。

(M):M. incognita(根結線蟲);(H):H. beicherriana(昆蟲病原線蟲);(SA):土壤修復劑125倍稀釋液圖1 根結線蟲二齡幼蟲J2與H. beicherriana 三齡幼蟲J3在溶液中7、14和21 d后的存活數與死亡數Fig.1 Survival number of M. incognita (J2) and H. beicherriana (J3) in solution after 7, 14, 21 days
如圖1所示,實驗7 d后,與昆蟲病原線蟲清水對照(H)比較,3個處理組(M+H+SA,H+SA,M+H)的昆蟲病原線蟲(J3)存活數量無顯著差別,且3個處理之間也無顯著差別(P<0.5),但H+SA 處理組的昆蟲病原線蟲(J3)的死亡平均數顯著低于H組和其他2個處理組(M+H+SA,M+H)。實驗14天后,3個處理組的昆蟲病原線蟲(J2)存活數量顯著高于H對照組,且Cherry線蟲死亡數均低于H對照組。此時,3個處理組之間,昆蟲病原線蟲(J2)的存活數量和死亡數量仍然沒顯著差異。到實驗21 d時,2個處理組(M+H+SA,M+SA)的昆蟲病原線蟲(J2)死亡數顯著低于H對照組,約為清水對照的一半,而處理組(M+H)的昆蟲病原線蟲(J2)死亡數高于H對照組(圖 1D)。
2.2 SA協同昆蟲病原線蟲對黃瓜幼苗生長的影響
2.2.1 對黃瓜幼苗葉面積的影響 實驗30 d后,不同處理對黃瓜幼苗葉片面積的影響不同,從圖2可以看出,加入SA的2個處理組(M+H+SA、H +SA)的黃瓜葉片面積最大。從圖3A的數值中可以看出,水培30 d后的黃瓜幼苗葉片面積呈現了出顯著差異(P<0.5),M組的葉片面積最小,平均葉片面積僅20多cm2,2個處理組(M+H+SA、H +SA)最大,平均大于80 cm2,而CK和其余2個實驗處理組(M+SA、M+H)大小居中,都在50 cm2左右。
2.2.2 對黃瓜鮮重的影響 如圖3B所示,實驗30 d后,不同處理對黃瓜幼苗鮮重的影響也有顯著差異(P<0.5)。處理組(H +SA)的黃瓜幼苗鮮重最大,平均大于2.0 g,M組的黃瓜幼苗鮮重最小,平均小于1.0 g,而CK和其余3個實驗處理組(M+SA、M+H+SA、M+H)沒有明顯差距,都是在1.5 g左右。
2.2.3 對黃瓜株高的影響 從圖2可以看出,實驗30 d后,加入SA的2個處理組(M+H+SA、H +SA)的黃瓜幼苗最高。從圖3C的數值中可以看出,在整個實驗期(30 d)后,清水對照組CK和3個處理組(M+H、H+SA、M+H+SA)的黃瓜幼苗株高無顯著差別,均值在11 cm左右,而M+H+SA處理組的黃瓜幼苗略高,大于12 cm。其余2個處理組(M和M+SA)的黃瓜幼苗顯著低于處理組(M+H+SA),但與處理組(M+H、H+SA)無明顯差異。
2.2.4 對黃瓜幼苗根系與根結率的影響 如圖2所示,實驗30 d后,加入SA的2個處理組(M+H+SA、H +SA)的黃瓜幼苗根系較其他組發達,而M組的幼苗根系明顯發育受阻。黃瓜幼苗每10 cm根長的根結數如圖3D,CK和處理組H+SA的黃瓜幼苗根上并沒有發現根結,其他3個處理組(M+SA、M+H、M+H+SA)的黃瓜根結數并無顯著差異,(M+SA、M+H)為每10 cm約4個根結,(M+H+SA)略高于2個,而M處理組的黃瓜幼苗根的根結數較多,接近每10 cm有8個根結。

CK:清水對照;M:M. incognita(根結線蟲);EPN:H. beicherriana(昆蟲病原線蟲);SA:土壤修復劑125倍稀釋液圖3 SA協同昆蟲病原線蟲對黃瓜幼苗生長的影響(30 d后)Fig.2 Effect of entomopathogenic nematode combining with SA on cucumber seedling after 30 days

CK:清水對照;M:M. incognita(根結線蟲);H:H. beicherriana(昆蟲病原線蟲);SA:土壤修復劑125倍稀釋液圖4 SA協同昆蟲病原線蟲對黃瓜幼苗葉面積、植株鮮重、株高、根結率的影響(30 d后)Fig.4 Effect of entomopathogenic nematode combining with SA on leaf area, fresh weight, height and root knot number per 10 cm root of cucumber after 30 days
土壤修復劑SA不僅對昆蟲病原線蟲(H.beicherriana)無毒殺等不良影響,還對昆蟲病原線蟲有一定的營養支持作用,當將H.beicherriana線蟲的三齡侵染期幼蟲(J3)置入SA的125倍稀釋溶液中,與清水對照比較,實驗期間的存活數較多且存活時間更長,平均死亡數量較少;但由于根結線蟲與昆蟲病原線蟲對溶液載體中氧氣的競爭的結果,使兩者因缺氧而死的數量增加。實驗前期,使用土壤修復劑SA的處理中,根結線蟲的二齡幼蟲(J2)存活數量減少迅速,根結線蟲死亡數量增加,而在實驗后期,SA溶解了一部分根結線蟲(J2)的尸體,導致后期加入SA的2個處理(M+H、M+H+SA)可以觀察到的根結線蟲死亡個體少于沒有SA的處理(M+H)。
土壤修復劑SA協同昆蟲病原線蟲(H.beicherriana)在抑制根結線蟲二齡幼蟲(J2)存活有增益效果,比單獨使用土壤修復劑SA或昆蟲病原線蟲對根結線蟲二齡幼蟲毒殺作用都要顯著。這可能是由于土壤修復劑SA含有較多的甲殼素(幾丁質)和各類小分子有機酸,對根結線蟲二齡幼蟲有毒殺作用,且對其有溶解效用,而昆蟲病原線蟲在實驗前期無明顯根結毒殺線蟲的效應,但后期對根結線蟲有毒殺作用明顯,因為昆蟲病原線蟲死亡后,共生菌釋放出來,會產生二齡幼蟲不利的作用,這可能是由于共生菌可以在SA中存活(類似天然的液體培養基),代謝的過程中,產生對根結線蟲的毒素物質,增強了對根結線蟲此階段的抑制作用。
實驗30 d后,施入土壤修復劑SA和昆蟲病原線蟲的處理組(M+H+SA、H+SA)的黃瓜葉片面積顯著增大,H +SA的黃瓜幼苗鮮重最大,M組的黃瓜幼苗鮮重最小, M+H+SA處理組的黃瓜幼苗略高,說明土壤修復劑有促進黃瓜地上部分生長的作用,明顯好于清水和線蟲對照并,且兩者(土壤修復劑SA和昆蟲病原線蟲)復合施用后效果增益。黃瓜幼苗每10 cm根長的根結數在實驗開始第30天時,CK和處理組H+SA的黃瓜幼苗根上并沒有發現根結,而M處理組的黃瓜幼苗根的根結數較多,表明土壤修復劑和昆蟲病原線蟲協同可以阻止部分根結線蟲侵入根系組織,或對其侵入根系造成一定的延遲,二者中昆蟲病原線蟲主要起抑制作用,而土壤修復劑SA則表現出促進作物根系生長的能力。此階段,土壤修復劑SA對根系結構的鞏固發揮作用,能適當阻礙部分根結線蟲的更加深入,并可以阻斷根結線蟲的營養來源(巨大細胞),減緩或阻止根結線蟲的發育[6,23]。前期進行了一系列的研究,對受南方根結線蟲侵染的黃瓜幼根進行了組織病理學觀察實驗,對幼苗根系根結的形成具有了一定的組織學層面的認識研究認為,無論施用土壤修復劑SA的時間長短,作用效果的表現都有一定的延后性,即使在播種之初施用土壤修復劑SA,其促進生長抑制根結的作用效果明顯表現在外觀生長情況上也需幼苗生長1個月左右。并認為是土壤修復劑SA的主要作用是提高了中柱鞘細胞的數量和排列密度,這就給根結線蟲的進入帶來了一定的難度,甚至是阻止了線蟲將頭部進一步進入維管束,為此減少了線蟲對根系生長的為害。施入SA后,不能刺激根系產生巨大細胞,所以導致根結線蟲最終會因營養物質的缺乏而死去,由此線蟲的蟲口密度也降低,進而對作物的為害得到降低[20,22]。
總體上,土壤修復劑SA協同昆蟲病原線蟲(H.beicherriana)在抑制根結線蟲二齡幼蟲(J2)存活有增益效果,對根結線蟲二齡幼蟲毒殺作用顯著。此外,土壤修復劑SA協同昆蟲病原線蟲加入到添加根結線蟲的黃瓜土壤中,可以使黃瓜植株總重、根重、根長、葉面積增加,單位長度內根結數量減少,提高使植株營養物質轉化能力增加,干物質積累增多,最終提高植株抵抗根結線蟲能力,減少根結線蟲對根系危害,從而緩解了南方根結線對黃瓜在生產上的危害。
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(責任編輯 陳 虹)
Effect of Entomopathogenic Nematode Combining with Soil Amendment on Root-knot NematodeMeloidogyneincognitaand Cucumber Growth
LI Xing-yue1,2, LIU Qi-zhi2*, LI He-qin2,3, ZHANG Lin-lin2,4, ZHANG Hong1
(1.Laboratory of Entomology and Nematology, College of Agriculture and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2.Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southwest, Institute of Plant Protection, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066, China; 3.Shandong Provincial Key Laboratory of Dryland Technology, College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University, Shandong Qingdao 266109, China; 4.Changli Institute of Pomology, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Hebei Changli 066600, China)
In order to investigate the effect of soil amendment (SA) together with entomopathogenic nematode (EPN,Heterorhabditisbeicherriana) on root-knot nematodes (Meloidogyneincognita) and the growth of cucumber plants, Qian-qiu No.1, as the tested cucumber cultivar, was chosen to be studied under lab condition., through artificial inoculation of root-knot nematode. The second juveniles (J2) of root-knot nematode and the third juveniles (J3) of EPN were observed after 7, 14 and 21 days, respectively. Moreover, the leaf area, plant height, fresh weight and root knot number of cucumber seedling were checked after 30 days. The results demonstrated that the survival numbers of root knot nematodes (J2) in trials treated by SA and EPN were significantly lower than that in control trial with just water (M) after 7, 14 and 21 days, respectively. After 21 days, the death number of root knot nematodes in SA trial was about twice of that in in control trial, while the death number of root knot nematodes in EPN trial was about three times of that in in control trial. However, the survival rate of EPN in SA treatment trial was obviously higher than those in other trials all through the experimental period. Moreover, SA together with EPN could increase the leaf area, fresh weight, plants height of cucumber seedling, but decreased the root-knot number within certain length of cucumber root. Above all, it was concluded that SA together with EPN could improve the resistant ability of the plants against root knot nematodes and reduce the damage caused by root knot nematodes, which provided theoretical basis for future study on effective amendment technology on soil contaminated by root-knot nematodes.
Soil amendment; Entomopathogenic nematode;Meloidogyneincognita;CucumissativusL.; Root-knot number
1001-4829(2016)09-2144-06
10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.023
2015-10-12
國家科技支撐項目(2014BAD16B07-2);農業部公益性行業(農業)科研專項(201503127)
李星月(1987-),女,四川內江人,博士,主要從事有害生物綜合防治研究,E-mail: michelle0919lee@126.com,*為通訊作者,劉奇志,E-mail: lqzzyx163@163.com。
S436.639
A