天女花與廣玉蘭雜交F1代的ISSR遺傳多樣性分析

王明媚, Kevin Parris, ZHANG Dong-lin, 金曉玲，李志輝, 楊玉潔

(1.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004; 2.佐治亞大學，美國佐治亞州 雅典 30602; 3.克萊姆森大學，美國南卡萊羅納州 克萊姆森 29634; 4.長江大學，湖北 荊州 434025)

天女花與廣玉蘭雜交F1代的ISSR遺傳多樣性分析

王明媚1,2, Kevin Parris3, ZHANG Dong-lin2*, 金曉玲1*，李志輝1, 楊玉潔4

(1.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004; 2.佐治亞大學，美國佐治亞州 雅典 30602; 3.克萊姆森大學，美國南卡萊羅納州 克萊姆森 29634; 4.長江大學，湖北 荊州 434025)

利用ISSR分子標記技術探討了天女花與廣玉蘭雜交后代9株幼苗的遺傳多樣性。9株F1代幼苗根據生長健壯的情況依次標記為SA、SB、SC、SD、SE、SF,、SG、SH、SI。選用10個ISSR引物對親本以及9株F1代幼苗的基因組進行分析。結果表明，11株植物共擴增出96條DNA條帶，其中多態性條帶為85條，占總條帶的88.5 %。UPGMA聚類結果表明所有F1代幼苗與六倍體父本更為相似，與二倍體的母本遺傳距離較遠。其中SC無論從葉片大小、邊緣的形態在9株F1代幼苗中與父本最相似，SG葉片為披針形，在9株F1代幼苗中較為特殊。其余7株F1代幼苗日漸成熟后再根據UPGMA聚類樹狀圖進行形態多樣性分析。

F1代遺傳多樣性；種間雜交；ISSR分子標記技術；天女花；廣玉蘭；多態性條帶

天女花，原產于中國、日本以及朝鮮半島[1-2]，二倍體(2n=2x=38)[3]落葉灌木或小喬木，一年多個花期，花白色，紅色雄蕊。在美國4～8帶地域生長良好。廣玉蘭，塔形，原產于美國弗吉尼亞州至佛羅里達州，東至田納西州，抗寒性極強，六倍體(2n=6x=114)[3]常綠喬木，花白色。根據種間雜交以及不同倍性間的雜交[2,4]經驗，兩個品種均具有極大的育種潛力。具有豐富育種經驗的木蘭科育種學家Dennis Ledvina 是第一個從天女花與廣玉蘭雜交后代中選擇出具有商業價值產品的人。參照Ledvina 先生的經驗，于2013年5月在美國南卡萊羅納州斯巴坦堡社區學院樹木園對天女花和廣玉蘭進行雜交。3個月后收獲到雜交種子并通過懸浮法獲得25顆具有活力的F1代種子。去掉假種皮，用10 %的次氯酸鈉進行沖洗后把種子輕輕放在濕潤的泥炭塊中冷處理5個月。2014年3月共有21顆種子萌發。萌發后，有9株F1代幼苗(根據生長健壯的情況依次標記為SA, SB, SC, SD, SE, SF, SG, SH, SI)被移栽到1加侖的容器中。通過流式細胞計數法測得所有的F1代育苗的染色體倍性為四倍體(2n=4x=76)[3]。后期生長表明，所有F1代幼苗葉片均為常綠，同六倍體父本一致。但是，葉片的大小、形狀以及顏色各有不同。且由于F1代幼苗樹齡小，其生長習性和花的特征了解不很清楚。因此，有必要進行DNA分子鑒定掌握F1代的遺傳變異。

分子技術，像cpDNA分析[5]，已經廣泛應用于木蘭科植物的研究中。ISSR分子標記技術是一種新的植物遺傳性研究技術[6-7]。分子技術廣泛應用于植物遺傳結構、遺傳多樣性以及遺傳關系的研究中[8]。在此研究中，本文試圖分析出F1代與親本之間的遺傳變異以及F1代幼苗之間的遺傳多樣性，為木蘭科F2代優良植株的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗選取2個親本和生命力旺盛的9株F1代幼苗(SA, SB, SC, SD, SE, SF, SG, SH, SI)上的新鮮葉片提取DNA。

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA提取 從F1代9株幼苗以及2個親本植株上均選取1片新鮮健康的葉片，用其一小部分放在液氮中提取DNA，多余葉片放在-80 ℃冰箱中儲存。使用DNA提取試劑盒QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit提取DNA。

1.2.2 DNA質量檢測 提取的DNA樣品用spectrophotometer (ThermoScientific NanoDrop Lite)紫外分光光度計測定波長260和280 nm的光吸收值，以A260/A280比值判斷DNA樣品的純度，并直接觀測紫外分光光度計上樣品的濃度。檢測完畢的DNA放在-20 ℃冰箱中儲存待用。本試驗以2個親本以及9個F1代DNA為模板，從100個ISSR引物中篩選出10個擴增條帶清晰的引物用于11個植物的ISSR分析。

1.2.3 ISSR-PCR反應體系及反應循環參數 PCR反應體系(20 μl)為：AmpliTaqGold 360 Master Mix 10 μl，模板DNA 3 μl，引物 1 μl，最后用ddH2O補足至20 μl。

PCR反應采用如下循環參數定為：預變性94 ℃ 5 min，在變性94 ℃ 30 s，退火50～60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 1.5 min循環40次，最后一次延伸為72 ℃ 7 min，然后設置PCR溫度為4 ℃。

1.2.4 2個親本以及9個F1代樣本的ISSR-PCR擴增 用篩選的引物對11個DNA樣本在相應的退火溫度下進行PCR擴增，擴增產物于1.2 %瓊脂糖凝膠并加入2滴EB于0.5X緩沖液中電泳，電壓120 V，約80 min后取出。使用100 bp DNA ladder作為參照標準，凝膠在UV燈下進行觀察拍照。

1.2.5 數據統計 PCR擴增產物在凝膠的某個相同遷移率的具體位置上有DNA條帶記為1，無DNA條帶記為0。剔除模糊不清晰的條帶。使用PAUP 4.0 分析和估計親代與F1之間的基因差異。

2 結果與分析

2.1 ISSR-PCR引物退火溫度的篩選

ISSR對PCR退火溫度極為敏感，同一引物對于不同退火溫度不一樣，而同一物種不同的引物，退火溫度也不相同。因此，對于ISSR分析而言，引物的篩選和退火溫度至關重要。本試驗從100個ISSR引物中逐步篩選出10個擴增條帶清晰的引物，這10個ISSR引物相應的退火溫度在52～56 ℃，其中引物UBC807，UBC811，UBC812，UBC827，UBC828退火溫度最低，為52 ℃；引物UBC834，UBC835退火溫度最高，為56 ℃。

2.2 ISSR-PCR擴增結果及11個樣本的遺傳多態性

10個ISSR引物共擴增出96條清晰的條帶，條帶大小為200～1500 bp，其中85條具有多態性，比例為88.5 %。不同引物擴增大條帶數為7～15。平均每個引物擴增的條帶數為9.6。其中引物UBC817擴增出的具有多態性條帶比例最高，為100.0 %；引物UBC817擴增出的具有多態性條帶比例最低，為57.1 %(表1)。對于每個分類單元，擴增出的條帶數介于45(XX，Magnoliasieboldii‘Colossus’)至58(SG和SI)之間。

2.3 遺傳距離分析

供試材料的遺傳距離在0.167～0.604。因為天女花(Magnoliasieboldii‘Colossus’)(XX) 為落葉，葉背沒有棕色絨毛，且葉片較大，而廣玉蘭 (Magnoliagrandiflora‘Kay Parris’)(XY) 葉片較小且常綠。經過ISSR分析，它們之間的遺傳距離最大，為0.604。在F1代樣本之間，遺傳距離最小的兩個樣本為SH和SI，它們之間的遺傳距離為0.167；遺傳距離最大的2個樣本為SA和SG，它們之間的遺傳距離為0.396。F1代樣本與母本之間的平均遺傳距離為0.279，與父本之間的平均遺傳距離為0.494。從遺傳距離上看，六倍體父本比二倍體母本的貢獻力大。

2.4 ISSR聚類分析樹狀圖

根據ISSR數據結果，按UPGMA法構建了親本與9個F1代樣本之間的遺傳關系聚類分析樹狀圖(圖1)。從聚類圖中可以看出，可將11個供試材料分為2類。

表1 10個引物序列、退火溫度、擴增條帶數以及多態性

圖1 ISSR分析親本與F1代樣本聚類樹狀圖Fig.1 Dengrogram of Magnolia parents and F1 siblings based on ISSR data

第1類為母本。第2類為父本及9個F1代樣本，第2類中又分為4個亞類(圖1)。父本與SC之間遺傳距離最近為0.219。且從形態學上觀察，SC葉片的形狀以及大小最接近父本。SH和SI均具有小葉片，生長緩慢，以及相似的樹形。兩者從遺傳角度分析，也是遺傳距離最接近的兩個F1代樣本。這4個樣本被聚為第1個亞類。第2個亞類包含生長最快的SA，以及亞聚類SB和SF。從遺傳距離上判斷它們彼此接近，但從目前的生長及形態特征上無顯著差異。第3個亞類包含SD和SE。且它們也具有相似的形態特征。第4個亞類為SG，是唯一的具有可辨別的絨毛葉片的植株。

3 結論與討論

(1)特異性條帶與條帶組合類型對將來的研究至關重要[12]。在此試驗中，共獲得17條特異性條帶，其中8條來自母本，只有1條來自父本。通過親本DNA重組，4個F1代樣本中出現特異性條帶。分別為SE和SG均有3條，SC和SD各有1條。因為SG葉片為披針形且有3條特異性條帶，很可能控制披針形葉片形狀的基因是3條特異性條帶中的1條。但是，此假設還需要進一步證實。由于F1代樣本較小，生長程度還不足以去推測帶型與生長的關系，需要進一步的研究。

(2)ISSR分析結果表明SC與父本之間的親緣關系最近，且所有F1代樣本均與父本相似。這也證實了F1代樣本基因組DNA從母本與父本獲得的基因組DNA的比例為1∶3。通過ISSR分析，9個F1代樣本與父本分享11條帶，而只有3條帶是9個F1代樣本從母本獲得。待9個F1代樣本成熟將繼續觀察其生長習性以及花的特征，為未來木蘭科育種做準備。

[1]Callaway D J. The world ofMagnolias[J]. Timber Press, Portland, USA,1994.

[2]Parris J K.Magnoliagrandiflora, a noble species with a complementary court of cultivars[J]. Royal Horticulture Society’s Rhododendron, Camellia, Magnolia Yearbook. Devon, UK,2012,75-89.

[3]Parris J K, T.G. Ranney, H.T. Knap W.V. Baird. Ploidy levels, relative genome sizes, and base pair composition inMagnolia[J]. J. Amer. Soc. Hort. Sci, 2010, 135(6): 533-547.

[4]Figlar, R.B. , H.P. Nooteboom. Notes on Magnoliaceae IV. Blumea, 2004, 49:1-14.

[5]Azuma H, L.B. Thien, S. Kaeano. Molecular phylogeny ofMagnoliabased on chloroplast DNA sequence data and floral scent chemistry[J]. Proc. Intl. Symp. Family Magnoliaceae, 2000, 219-227.

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(責任編輯 李 潔)

Genetic Variation ofMagnoliasieboldiiK. Koch ‘Colossus’ andMagnoliagrandifloraL.‘Kay Parris’ F1Seedlings Using ISSR Markers

WANG Ming-mei1, 2, PARRIS Kevin3, ZHANG Dong-lin2*, JIN Xiao-ling1, LI Zhi-hui1, YANG Yu-jie4

(1.Central South University of Forestry and Technology, Hunan Changsha 410004, China; 2.University of Georgia, Athens, GA 30602, USA; 3.Clemson University, Clemson, SC 29634, USA; 4.Yangtze University, Hubei Jingzhou 434025, China)

ISSR markers were used to analyze genetic variations and assessed inheritance of nine F1seedlings. Plants were accessioned and assigned a letter, with A being the most vigorous and I being the least vigorous individuals. A total of 96 bands were generated from 10 primers, in which 85 bands (88.5 %) were polymorphic. UPGMA tree revealed that all the seedlings were much closer to their hexaploid pollen parent (M.grandiflora‘Kay Parris’) and more distant from their diploid seed parent(M.sieboldii‘Colossus’), supporting early foliage morphology. Seedling C is the most similar to the pollen parent, both in regard to foliage proportions, margin undulation, and proximity. Seedling G is unique among the F1, displaying lanceolate leaves. Other seedlings grouped within the tree have slight morphological variations that may be analyzed for correlation to the UPGMA tree as they continue to mature and growth habit variations become evident.

F1variation; Interspecific hybrid; ISSR markers;Magnoliasieboldii‘Colossus’;Magnoliagrandiflora‘Kay Parris’; Polymorphic bands

1001-4829(2016)09-2225-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.09.037

2015-10-12

林業公益性行業科研專項經費資助項目(2014047 10)

王明媚(1989-)，女，河北唐山人，森林培育碩士研究生，E-mail: mingmei16@sina.cn, *為通訊作者。

S685.15

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