表達黑色素瘤抗原-A3重組質粒的免疫原性研究

岳紅紅, 趙 亮, 姜 威

表達黑色素瘤抗原-A3重組質粒的免疫原性研究

岳紅紅1, 趙 亮2, 姜 威2

目的 對新型肺癌基因疫苗的免疫原性進行評價。 方法 利用Furin 2A將黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)基因與GM-CSF基因進行連接，克隆入真核表達載體pVAX1，構建基因疫苗pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF。將該疫苗體外轉染293T細胞，利用免疫印跡和ELISA的方法對其表達情況進行檢測。然后，將疫苗及對照組分別免疫接種小鼠，通過ELISA和ELISPOT法初步檢測其誘導的體液免疫和細胞免疫反應。 結果 成功克隆并構建了肺癌基因疫苗pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF，并證實了其在真核細胞中表達。疫苗免疫接種小鼠模型后的檢測結果顯示，與空載體對照組以及單獨抗原組相比，pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF能夠誘導產生更強的體液免疫反應和細胞免疫反應。結論 pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF能夠同時誘導較強的體液免疫和細胞免疫反應，其抗腫瘤效應將通過進一步實驗深入研究。

黑色素瘤相關抗原 A3 (MAGE-A3)；肺癌；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；基因疫苗

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，已成為死亡的首要病因。據統計，每年新確診肺癌達160 萬，每年有 140 萬人死于肺癌[1]。 肺癌最常見的組織學類型是非小細胞肺癌 (nonsmall-cell lung cancer, NSCLC)，占肺癌總數的 81%，有 60% 患者在就診時已屬進展期或難以治愈的Ⅲ b期或Ⅳ期，失去了手術機會，預后極差[2]。尋找有效的治療方法是當務之急。近年來，隨著靶向治療和免疫治療等新興療法的出現，NSCLC 的臨床治療取得了很大的進展。作為主動免疫治療方式的基因疫苗由于其能夠誘導強烈的細胞免疫應答，在腫瘤的免疫治療研究中成為熱點之一[3]。在免疫治療中，靶抗原的選擇對治療的特異性和有效性具有重要的作用。MAGE-A3 在肺癌等多種腫瘤細胞表達，是真正的腫瘤特異性抗原。MAGE-A3重組蛋白和免疫佐劑組成的蛋白疫苗用于肺癌治療的研究已有報道。本研究將MAGE-A3基因與粒-巨噬細胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)基因構建于同一個真核表達載體，并對其誘導的體液和細胞免疫反應進行初步評價。

1 材料與方法

1.1 基因疫苗的構建和鑒定 將MAGE-A3(GenBank：GI 29029622)的胞外段編碼區和GM-CSF(GenBank序列號: M11220.1)的編碼區基因之間以Furin /2A[弗林蛋白酶(Furin)/口蹄疫病毒2A多肽序列進行連接，構成融合基因MAGE-A3-F2A-GM-CSF，融合基因的上、下游分別引入酶切位點BamHⅠ和 EcoRⅠ。融合基因在Invitrogen公司進行全基因合成，然后將其克隆至基因疫苗常用表達載體pVAX1，獲得基因疫苗pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF。利用限制性內切酶的酶切和基因測序對基因疫苗進行鑒定。主要步驟：利用NEB公司的內切酶BamHⅠ(R0136V)和EcoRⅠ(R0101V)，對獲得的基因疫苗進行酶切，能夠切下與目的基因MAGE-A3-F2A-GM-CSF大小一致的條帶，即為構建成功。1.2 基因疫苗的真核表達 為了驗證pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF的真核表達情況，利用Invitrogen公司提供的脂質體2000將其轉染至293T細胞(購于協和細胞庫)，分別收集細胞培養上清液和六孔板中的細胞進行檢測。轉染簡要步驟如下：轉染前一天，將對數生長期的293T細胞接種于6孔培養板，到轉染時的細胞匯合度應達到80%；利用無血清培養基分別配置轉染A液和B液，A液含有10 μl的轉染試劑，B液含有4 μg的轉染級質粒，A和B液在室溫下放置5 min后，將A液加入到B液中，此為C液，輕柔混勻，室溫放置20 min。將C液小心的加入到含有2 ml培養基和80%匯合度細胞的6孔培養板中，輕柔混勻，置于細胞培養箱孵育5 h。孵育結束后，用新鮮培養基洗滌6孔板中的細胞，最后加入2 ml新鮮的完全培養液。轉染48 h后，進行檢測。為了檢測MAGE-A3的表達，將收集的轉染細胞洗滌后，用RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液裂解細胞，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS-PAGE)方法將細胞蛋白進行分離并轉移到聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，然后以鼠源抗人MAGE-A3抗體(Abcam公司)和HRP標記的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術公司)分別為一抗和二抗，并分別孵育,通過化學發光試劑 (electrochemiluminescence, ECL)顯色，并用化學發光儀拍照。GM-CSF是分泌表達，所以將轉染細胞培養上清液包被于96孔微板中，采用鼠源的抗人GM-CSF單克隆抗體(Abcam公司)作為一抗，二抗為辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術公司)，顯色并終止反應后，酶標儀檢測(美國伯樂公司，型號：Bio-Rad imark)波長在OD450處的吸光度值，樣品孔數值大于等于陰性孔數值2倍以上，認定為陽性。

1.3 實驗動物分組和免疫接種 4～6周齡的雌性BalB/c小鼠購自于北京維通利華實驗動物技術公司，體重20～25 g，實驗動物的喂養按照“實驗動物的護理和使用指南”的要求執行。32只實驗小鼠隨機分為4組(配對比較法隨機分組),空白對照組、空質粒pVAX1組，pVAX1- MAGE-A3組和pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF組，每組8只。每只小鼠肌肉注射50 μg質粒，并進行電穿孔刺激，分別在一免后的第7天和第14天加強免疫。末次免疫后的第14天，處死小鼠后進行免疫原性檢測。

1.4 抗體滴度檢測和ELISPOT檢測 免疫結束后2周，分離血清，小鼠眼眶取血100 μl左右，室溫下自然沉淀2～3 h，然后1500 r/min，離心5 min后分離血清，檢測小鼠血清中的抗體滴度。將l0 μg重組MAGE-A3抗原(Abcam公司)包被于96孔微板中，然后加入系列稀釋的各實驗組小鼠血清，孵育洗滌后，加入HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體，孵育洗滌后，3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺溶液(Tetramethylbenzidine，TMB)顯色，反應終止后，酶標儀OD450波長處讀取數值。實驗組OD450的數值大于等于陰性對照2倍為陽性。酶聯免疫斑點試驗(enzyme linked immunospot，ELISOPT)的實驗步驟為：用抗IFN-γ抗體包被PVDF板，將分離的小鼠脾細胞分別加入到包被孔中，MAGE-A3抗原疫苗組加入MAGE-A3蛋白作為刺激物，無刺激抗原的做為陰性對照，陽性對照加入佛波酯(Phorbol ester，PMA)，具體操作過程按照ELISPOT試劑盒說明進行。

1.5 統計學處理 采用GraphPad Prism 5進行統計學分析，組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基因疫苗的構建和抗原表達檢測 基因疫苗構建如前所述，進行測序鑒定正確后，將其轉染293T細胞，轉染48 h后分別收獲細胞和細胞培養上清液。收獲的細胞裂解后轉移至PVDF膜上后，分別與鼠源抗人MAGE-A3抗體及HRP標記的山羊抗小鼠IgG進行孵育，并經過ECL顯色，化學發光儀能檢測到特異性條帶，表明MAGE-A3在293T細胞中能夠表達(圖1A)。GM-CSF是分泌表達，可以用ELISA法檢測轉染后的細胞培養上清。將轉染上清包被ELISA板孔以后，用鼠源的抗GM-CSF單克隆抗體作為一抗進行孵育，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG作為第二抗體進行標記。通過TMB顯色后，檢測表達情況。ELISA檢測的結果顯示，GM-CSF(圖1B)檢測組OD平均值明顯高于空白對照組和空載體組，證明GM-CSF在293T細胞內能夠有效分泌表達。

圖1 黑色素瘤抗原-A3流式細胞術和

ELISA法檢測重組質粒的表達

A.利用免疫印記法(western blot)檢測基因疫苗中抗原MAGE-A3的表達；B.利用ELISA法檢測基因疫苗中佐劑分子GM-CSF的表達

2.2 ELISA檢測疫苗誘導的體液免疫應答 末次免疫后的第2周，處死各實驗組的小鼠，并收集血清，檢測疫苗誘導的抗原特異性抗體反應。將各組血清進行系列稀釋后，與包被于微板上的MAGE-A3蛋白抗原進行孵育，孵育結束后，用辣根過氧化物酶標記的二抗進行標記，酶標儀讀數。結果如圖2A所示，單獨抗原組pVAX1- MAGE-A3和融合抗原組pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF都能產生一定強度的抗體反應，然而融合抗原組pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF誘導的抗體水平顯著高于單獨抗原組(P<0.05)(圖2B)。這個結果說明，將MAGE-A3抗原與GM-CSF融合表達，能夠顯著提高MAGE-A3誘導的特異性抗體的產生，增強了體液免疫反應。

2.3 ELISPOT法檢測疫苗誘導的細胞免疫應答 末次免疫后的第2周，處死各實驗組的小鼠，手術解剖小鼠并取其脾臟淋巴細胞，檢測疫苗誘導的IFN-γ分泌的特異細胞免疫反應。通過圖3可以看出，與對照組相比，無論是單獨抗原組還是融合抗原組免疫小鼠后的脾臟淋巴細胞，經特異性抗原MAGE-A3刺激后，均能產生IFN-γ分泌的斑點。而與單獨抗原對照組相比，表達融合抗原的基因疫苗免疫后的小鼠能夠產生更加強烈的細胞免疫反應。融合抗原疫苗組的小鼠脾細胞分泌IFN-γ的能力要顯著高于單獨抗原對照組(P<0.001)。

圖2 黑色素瘤抗-A3各實驗組抗體滴度分析

圖3 黑色素瘤抗原-A3各實驗組ELISPOT檢測分析

3 討 論

近年來，肺癌的發病率在逐年提高，尤其是非小細胞肺癌治療難度較大。傳統的肺癌治療方法，如放療、化療和手術等，雖然能在一定程度上減輕病痛，但是預后往往較差，容易復發和轉移。免疫治療是發展非常迅速的腫瘤治療的新型手段，并取得了一些重要突破性進展[4]。其中腫瘤治療性疫苗，由于其能夠誘導機體產生強烈的抗腫瘤免疫作用，逐漸成為研究熱點之一[5]。在治療性疫苗的研究中，由于以質粒DNA為載體的疫苗能夠誘導強烈的細胞免疫，如Th1和CTL殺傷反應[6]，其被多用于研發針對惡性腫瘤和一些慢性感染性疾病的治療性疫苗。然而，由于DNA疫苗的免疫原性較低，其研究和發展受到了一定的限制，曾經一度出現停滯不前的現象。但是，自從將在體電脈沖轉染這種高效的基因疫苗遞送方式用于基因疫苗的免疫接種后，其發展非常迅速[7]。當然，提高基因疫苗效果的方法很多，將具有免疫刺激和調節功能的細胞因子，以分子內佐劑的方式與腫瘤抗原融合，也是研究熱點之一。GM-CSF是當前研究最多最具發展潛力的免疫刺激分子之一，它能夠刺激多種免疫細胞，例如樹突狀細胞(dendritic cells，DC)、巨噬細胞等發育和活化，具有重要的免疫調節功能。目前，已經有很多學者將其以輔助分子或者分子內佐劑的方式加以應用，都體現了其良好的抗腫瘤或者提高抑瘤效果的能力[8]。

MAGE-A3是肺癌靶向治療中研究較多的一個靶抗原，其在多種惡性腫瘤中高表達，以MAGE-A3為靶點的肺癌疫苗已經分別有一項Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗[9]。而以MAGE-A3為靶抗原的基因疫苗也取得了較為理想的結果，因此，MAGE-A3被看做是肺癌免疫治療的潛在理想靶抗原之一[10]。本研究將具有重要免疫調節功能的分子GM-CSF與非小細胞肺癌高表達抗原MAGE-A3進行融合表達，旨在通過分子內佐劑的方式來提高腫瘤抗原的免疫原性。通過ELISA和ELISPOT的方法分別檢測了該重組質粒免疫實驗小鼠后誘導的體液免疫反應和細胞免疫反應。結果顯示，與單獨表達抗原的質粒對照組相比，具有分子內佐劑的pVAX1- MAGE-A3-F2A-GM-CSF質粒能夠誘導機體產生較強的體液免疫反應和細胞免疫反應，這說明以GM-CSF作為分子內佐劑，與腫瘤抗原進行融合表達的方式，能夠提高抗原誘導特異性免疫應答的能力。

綜上所述，本研究結果對于腫瘤臨床治療具有一定的提示，對腫瘤的治療和治愈率的提高具有指導意義，聯合治療將成為腫瘤臨床治療的熱點發展方向之一。腫瘤患者應用治療性疫苗效果不明顯的原因，主要是因為免疫耐受和腫瘤的免疫逃逸，而將具有抗腫瘤活性的細胞因子、免疫檢查點抑制劑等，與具有主動免疫治療效果的免疫制劑、腫瘤疫苗進行聯合治療，將會從很大程度上打破免疫耐受和抑制腫瘤免疫逃逸的途徑。下一步，將利用腫瘤荷瘤小鼠模型，對該疫苗抑制腫瘤的效果進行深入研究。同時將利用其他肺癌靶抗原和成熟的佐劑分子及免疫監測點抑制劑聯合應用的方式，進一步提高和改善疫苗的效果，以期獲得一個良好的非小細胞肺癌治療性基因疫苗候選品種。

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(2016-05-15收稿 2016-09-28修回)

(責任編輯 郭 青)

Immunogenicity analysis of recombinant plasmid harboring MAGE-A3 antigens

YUE Honghong1， ZHAO Liang2， and JIANG Wei2.1. Branch of Allergic Reactions, 2. Medical Department, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force,Beijing 100039,China

Objective To construct a recombinant lung cancer DNA vaccine with high expression antigen MAGE-A3 in lung cancer and to evaluate its immunogenicity.Methods MAGE-A3 genes were fused with GM-CSF by F2A and cloned into pVAX1 to construct the gene vaccine ppVAX1-MAGE-A3-F2A-GM-CSF. After the gene vaccine was transfected into 293T cells, the expression of the gene vaccine was detected by Western blot and ELISA. Then, the gene vaccine and the control group were injected into the mouse model, and the immune activity was detected by ELISA and ELISPOT.Results Gene vaccine pVAX1-MAGE-A3-F2A-GM-CSF was constructed, and the expression of the antigen was confirmed. After the mice were vaccinated with the gene vaccine, the test results of ELISA and ELISPOT showed that pVAX1-MAGE-A3-F2A-GM-CSF induced both humoral immune response and cellular immune response compared with the control group.Conclusions pVAX1-MAGE-A3-F2A-GM-CSF can induce both humoral immune response and cellular immune response, and its potential anti-tumor effect needs to be further studied.

MAGE-A3；lung cancer;granulocyte-macrophage colony-stimulating factor；gene vaccine

岳紅紅，博士，主治醫師。

100039 北京，武警總醫院：1.過敏反應科，2.醫務部

姜 威， E-mail: wuweiwenzhang07@sohu.com

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