基于ITS條形碼序列對枸杞雜交種的早期鑒定

摘要：采用改進CTAB法提取枸杞（Lycium Linn）葉片DNA，利用合成的特異引物對其DNA中nrDNA ITS區進行擴增、克隆，對目的片段進行測序分析，以期利用ITS條形碼序列對枸杞雜交種進行早期鑒定。結果表明，7份枸杞屬不同種間雜交種的ITS序列長度變異范圍為558～632 bp，平均為610 bp。排序后的總長度為632 bp，整個轉錄間隔區（ITS1+ITS2）對位排列后總長度為478 bp，共有138個變異位點，ITS1和ITS2分別為85和53個，占28.9%；保守位點340個，占71.1%；有6個信息位點，占1.3%；51個轉換位點，12個顛換位點，其中ITS1區的信息位點所占比例低于ITS2區，而ITS1區的轉換位點與顛換位點比值高于ITS2區。通過對寧夏枸杞、北方枸杞、黑果枸杞及其種間雜交育種產生的雜交后代分析，得出基于ITS聚類分析能夠初步判別雜交后代與父母本的親緣關系與差異，可以作為早期鑒定枸杞屬不同種間雜交種后代的方法之一。

關鍵詞：枸杞（Lycium Linn）；ITS序列；鑒定；雜交育種

中圖分類號：S567.1+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）19-5075-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.045

Abstract：To identify Lycium Linn hybrids in early time by the nrDNA ITS sequence，using improved CTAB method to acquire DNA of Lycium Linn leaf， nrDNA ITS area of DNA was propagated and cloned by composite special primers，and sequence of the target segment was analyzed. The results show that the length variation range of nrDNA ITS sequence is 558～632 bp and the average is 610 bp. The length is 632 bp after sorting and the total length of ITS（ITS1+ITS2） is 478 bp by alignment，including 138 variation sites（85 variation sites in ITS1 and 53 variation sites in ITS2） which occupied 28.9%，340 conserved sites accounted for 71.1%. There are 6 information sites， 51 transformation sites and 12 transversion sites totally，but the proportion of information sites in ITS1 is lower than in ITS2，and the ratio of transformation sites and transversion sites in ITS1 is higher than in ITS2. According to analysis of L. ruthenicum Murr.，L. barbarum Linn.，L. chinense and the hybrids crossbred among these species，we could judge the genetic relationship and difference between hybrids and their parents based on nrDNA ITS sequence. In concluding，the nrDNA ITS sequence analysis is one way to identify Lycium crossbreeding among species in early time.

Key words： Lycium Linn； internal transcribed spacer； identification； crossbreeding

枸杞（Lycium Linn）富含枸杞多糖、甜菜堿、類胡蘿卜素、多種不飽和脂肪酸等多種有效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老、增強免疫力、軟化血管、降低血脂等功效，是中國重要的藥食同源功能型特色植物資源[1]。寧夏是枸杞的原產地和主產區，截至2015年底，寧夏種植規模達到5.71萬hm2，占全國種植總面積的42.5%；枸杞干果產量13萬t，占全國總產量的48%；年出口量6 500 t，出口額達7 000萬美元，分別占全國出口量和出口額的65%和58%；枸杞生產總值突破50億元。寧夏自20世紀60年代就已開展枸杞新品種育種工作，目前寧夏農林科學院自主選育出寧杞1號、寧杞2號、寧杞3號、寧杞5號、寧杞6號、寧杞7號、寧農杞9號等10余個新品種[2]，國內科技工作者也選育出柴杞1號、蒙杞1號、精杞1號等新品種。近年來，分子標記技術發展很快，對深入了解植物基因的多態性，有針對地選擇親本以及對雜種后代進行早期鑒定等方面都能提供更為有效的判斷依據，從而提高育種的效率[3]。通過群體選優、雜交育種、細胞融合等技術，建立多樣化育種理論體系和技術體系，培育多用途的枸杞新品種，對于提升枸杞產業的研究水平及枸杞產業的可持續發展具有重大意義。該研究以枸杞雜交育種親本和雜交品系為試驗材料，利用ITS條形碼序列對枸杞雜交育種進行早期鑒定，擬建立分子標記輔助育種技術，縮短育種周期。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以寧夏枸杞、北方枸杞、黑果枸杞和其種間雜交育種產生的雜交后代為試驗材料，具體見表1。

1.2 試驗方法

DNA提取參照文獻[4]的方法進行；PCR擴增引物的設計、擴增程序、反應體系及目的片段的克隆參照Shi等[5]的方法進行。

1.3 7份枸杞屬種質資源發育進化樹的構建

采用MEGA 4.0分析軟件對7份ITS測序結果構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 ITS區序列長度和變異信息

枸杞屬不同種間雜交種植物中，整個ITS序列長度變異范圍為558～632 bp，平均為610 bp。其中，整個ITS1序列長度變異范圍為197～253 bp，平均為236 bp；整個5.8S nrDNA序列長度都為154 bp；整個ITS2序列長度變異范圍為207～225 bp，平均為220 bp。ITS區和分區長度及（G+C）含量變異如表2所示，枸杞屬不同種間雜交種植物ITS序列特征如表3所示。

由表3可知，整個ITS區排序后的總長度為632 bp，其中ITS1、5.8S nrDNA和ITS2排序后的長度分別為253、154、225 bp。將gap（空位）作missing（缺失）處理時，由于5.8S nrDNA序列過于保守，在本研究中利用ITS1和ITS2區序列進行統計發育分析。整個轉錄間隔區（ITS1十ITS2）對位排列后總長度為478 bp，共有138個變異位點，ITS1和ITS2分別為85和53個，占28.9%；保守位點340個，占71.1%；有6個信息位點，占1.3%，51個轉換位點，12個顛換位點，其中ITS1區的信息位點所占比例低于ITS2區，而ITS1區的轉換位點與顛換位點比值高于ITS2區。

2.2 親緣關系分析

對ITS區堿基序列進行聚類分析，結果如圖1所示。從圖1可以看出各育種親本品種及其雜交種間的親緣關系與差異。其中，04-05-30是北方變種（北方枸杞）與寧杞1號（寧夏枸杞）的雜交種，基于ITS序列分析，雜種與其父本聚在一起，說明雜交種與父本有較好的親緣關系，可以作為判定雜交種的一個依據。04-03-32是寧杞1號與北方變種的雜交種，基于ITS序列分析，雜交種與其母本聚在一起，與父本親緣關系較遠。04-03-29是寧杞1號與北方變種的雜交種，基于ITS序列分析，雜交種與其父、母本相距較遠，相對于04-03-32雖然是相同的父母本，但其是否為父母本雜交后代的真實性判別依據不充分。04-05-01是北方枸杞與黑果枸杞的雜交種，基于ITS序列分析，雜交種與其父、母本相距較遠，同時具有父母本的序列特征，但其作為父母本雜交后代的真實性就較為肯定。

3 討論

枸杞是多年生灌木，成齡期在4年以上，雜交群體的保存目前多采用活體保存，占用大量的土地資源和人力，隨著雜交育種工作的開展，雜交群體的保存和早期鑒定對于提高育種、縮短育種周期尤為重要，亟須通過雜交后代的早期鑒定來克服和緩解龐大的雜交群體規模所帶來的困難和壓力。基于ITS序列差異，從聚類圖可以初步判斷父母本與雜交后代之間的親緣關系的遠近，而且結合其在植物學性狀、細胞學性狀、同工酶性狀等方面的差異，可以作為枸杞早期鑒定雜交后代的依據之一。

參考文獻：

[1] 馬德滋，劉惠蘭.寧夏植物志（第二卷）[M].銀川：寧夏人民出版社，1990.155-156.

[2] 安 巍，焦恩寧，石志剛，等.枸杞規范化栽培及加工技術[M].北京：金盾出版社，2005.

[3] 張漢明，許鐵蜂，秦路平，等.中藥鑒別研究的發展和現代鑒別技術介紹[J].中成藥，2000，22（1）：101.

[4] CHENG K T，CHANG H C，HUANG H，et al. RAPD analysis of Lycium bararum medicine in Taiwan market[J].Bot Bull Acad Sin，2000，41：11-14.

[5] SHI Z G，AN W，FAN Y F，et al. Preliminary studies on identification of Lycium Linn. germplasm resources by nrDNA ITS sequencing[J].Agricultural Science and Technology，2008，9（1）： 35-36.