不同溫度下穿心蓮種子萌發(fā)的生理生化特性研究

摘要：通過測定20、25、30 ℃溫度下穿心蓮[Andrographis paniculata （Burm. f.） Nees]種子不同萌發(fā)階段的可溶性糖、粗脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉、氨基酸含量及SOD、POD、CAT活性，分析不同溫度下種子萌發(fā)各階段生理生化特性。結(jié)果表明，不同溫度下，隨著穿心蓮種子的萌發(fā)進(jìn)程，種子萌發(fā)各階段可溶性糖、粗脂肪、淀粉含量變化趨勢基本相同；而可溶性蛋白質(zhì)含量在20、25 ℃條件下先減小后增加，30 ℃先增加后減小；過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（S0D）、過氧化氫酶（CAT）活性整體都表現(xiàn)出先增加后下降趨勢，但變化程度有所差異。25 ℃處理下種子在伸長階段后儲(chǔ)藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用要高于20、30 ℃處理下種子，在穿心蓮種子的萌發(fā)過程中，推薦以25 ℃為適宜溫度。

關(guān)鍵詞：穿心蓮[Andrographis paniculata （Burm. f.） Nees]；種子萌發(fā)；生理生化；溫度

中圖分類號：R282.2；S567.21 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）19-5083-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.19.048

Abstract：Dynamic changes of physiological and biochemical indexes of Andrographis paniculata（Burm. f.） Nees seed germination at different temperatures were analyzed by measuring the contents of soluble sugar，crude fat，protein，starch，amino acids and the activity of SOD，POD，CAT at 20，25 and 30 ℃，respectively at the different seed germination stages. Results showed that at different temperatures，with the Andrographis paniculata（Burm. f.） Nees seed germination process，the content changing trend of the soluble sugar，crude fat， starch of seed germination was basically the same. The soluble protein content was decreased at 20 ℃ and 25 ℃，and then decreased，but the opposite at 30 ℃，the activity of peroxidase （POD），superoxide dismutase（SOD） and catalase（CAT） increased firstly and then decreased，but the degree of variation were different. After elongation stage，transformation of substance storage use of the germination of seeds at 25 ℃ was higher than 20 ℃ and 30 ℃，it was recommended to 25 ℃ for optimum temperature in Andrographis paniculata（Burm. f.） Nees seeds germination.

Key words： Andrographis paniculata （Burm. f.） Nees；seed germination；physiology and biochemistry；temperature

穿心蓮來源于爵床科（Acanthaceae）植物穿心蓮[Andrographis paniculata （Burm. f.） Nees]的干燥地上部分，具有清熱解毒、涼血消腫的功效，對冠脈血栓性心肌梗塞有防治作用，也可抑制血小板聚集等[1]。穿心蓮一般采用種子繁殖，由于種子表面有蠟質(zhì)層，種皮較堅(jiān)硬，透性差[2]，因此在播種前采用有效的方法進(jìn)行種子處理對提高種子發(fā)芽率至關(guān)重要[3]。近年來，對穿心蓮的研究主要集中在其化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)等方面，而對于穿心蓮種子的萌發(fā)及生長機(jī)制的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。目前，農(nóng)作物種子萌發(fā)生理研究報(bào)道較多，而對于藥用草本植物種子萌發(fā)生理研究報(bào)道還較少[4]。本試驗(yàn)主要探索了穿心蓮種子萌發(fā)過程中主要的生理生化特性，進(jìn)一步了解穿心蓮種子萌發(fā)代謝生理生化過程，為探討穿心蓮種子萌發(fā)過程中代謝生理及穿心蓮生長提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

穿心蓮種子采自廣西貴港。經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心賴學(xué)文教授鑒定為爵床科植物穿心蓮的成熟果實(shí)。

1.2 儀器與試劑

蒽酮、抗壞血酸、苯駢戊三酮、L-亮氨酸、氫氧化鈉、高氯酸、葡萄糖、無水乙醇、無水乙醚，以上試劑均為分析純。

BP211D型電子天平、KQ3200型超聲波清洗器（昆山超聲儀器廠）、高速中藥粉碎機(jī)（YF-111B型，瑞安市永利制藥機(jī)械有限公司）、GZX-9146MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、UV-1800型紫外分光光度計(jì)（日本島津制作所）、LRH-250-Z型光照培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)處理 選擇大小、形狀、色澤、飽滿程度等外觀形態(tài)一致的穿心蓮種子，均勻排列于直徑為9 cm鋪有3層發(fā)芽濾紙的消毒培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿50粒種子，分別置于20、25、30 ℃的黑暗恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察，檢查并保持濾紙濕潤，以保證有充足的水分，分別在種子的不同萌發(fā)階段測定生理生化指標(biāo)。

1.3.2 生理生化指標(biāo)測定 可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[5]，淀粉含量測定采用高氯酸分解法，蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯基亮藍(lán)G-250染色法，游離氨基酸含量測定采用茚三酮顯色法，粗脂肪含量測定采用索氏提取法[6]；過氧化物酶POD活性測定參照辛霞等[7]的方法，略作改動(dòng)，反應(yīng)體系加入酶液后于470 nm處測定每1 min吸光度的增加值；超氧化物歧化酶SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法[8]；過氧化氫酶CAT活性測定參照李仕飛等[6]的方法，略做改動(dòng)，在25 ℃下反應(yīng)，測定240 nm下吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下穿心蓮種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量的變化

在種子貯藏與萌發(fā)過程中，可溶性糖是主要的呼吸底物及物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。從圖1中可以看出，不同溫度下穿心蓮種子內(nèi)可溶性糖含量在萌發(fā)的吸脹階段均呈下降趨勢，表明在吸脹過程中部分可溶性糖被消耗以提供種子萌發(fā)和生長所需能量或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)；在吸脹到起弓階段，30 ℃下種子可溶性糖含量的增加速度要高于20、25 ℃，可能是30 ℃下種子內(nèi)其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的速度高于20、25 ℃，即30 ℃萌發(fā)種子在該階段對糖的需要量要高于20、25 ℃的萌發(fā)階段，起弓階段后，30 ℃種子可溶性糖含量開始下降，20、25 ℃處理下的可溶性糖含量繼續(xù)增加，并在伸長階段高于30 ℃，隨后開始迅速下降。結(jié)果表明，在萌發(fā)過程中，吸脹階段前，3個(gè)溫度處理下的穿心蓮種子對可溶性糖的消耗量都很大，吸脹階段后，30 ℃處理的種子可溶性糖的合成量大于消耗量并且相對穩(wěn)定，而20、25 ℃處理的種子可溶性糖的合成量在伸長階段急劇增加，并在伸長到長葉階段可溶性糖的消耗量遠(yuǎn)大于生成量。

2.2 不同溫度下穿心蓮種子萌發(fā)過程中淀粉含量的變化

種子萌發(fā)過程中淀粉可水解或降解成葡萄糖，為其生命活動(dòng)及代謝過程提供能量保障[9]。在穿心蓮種子萌發(fā)過程中，在吸脹階段各處理的種子淀粉含量均下降，完成吸脹階段后隨即增加，到露白階段又開始下降，伸長階段再次增加，其中，在伸長階段20、25 ℃下萌發(fā)的種子淀粉含量下降相對較多，而在種子的整個(gè)萌發(fā)階段中，30 ℃處理下的種子淀粉含量均明顯高于20、25 ℃處理下的種子，由此可見，30 ℃下萌發(fā)的種子能量儲(chǔ)備和物質(zhì)基礎(chǔ)要高于20、25 ℃下萌發(fā)的種子（圖2）。

2.3 不同溫度下穿心蓮種子萌發(fā)過程中粗脂肪含量的變化

種子萌發(fā)過程中脂肪的分解利用與淀粉、蛋白質(zhì)關(guān)系密切[10]。從圖3可以看出，不同溫度下萌發(fā)態(tài)的種子在吸脹階段粗脂肪含量均明顯降低，吸脹到露白階段粗脂肪含量均增加，之后各個(gè)階段粗脂肪含量持續(xù)減少，而在整個(gè)萌發(fā)過程中，20、25 ℃處理下的種子脂肪含量均高于30 ℃處理下的種子，表明20、25 ℃處理的種子在整個(gè)階段對粗脂肪的分解利用要小于30 ℃。

2.4 不同溫度下穿心蓮種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白質(zhì)及游離氨基酸含量的變化

種子的萌發(fā)伴隨著各種物質(zhì)的利用與代謝，蛋白質(zhì)的分解最終以游離氨基酸的形式提供能量，這兩者的轉(zhuǎn)化利用在種子萌發(fā)過程中尤為重要[11]。

2.4.1 可溶性蛋白質(zhì)含量變化 研究結(jié)果（圖4）顯示，在吸脹與伸長兩個(gè)階段，20 ℃處理下的穿心蓮種子可溶性蛋白質(zhì)含量下降，表明20 ℃萌發(fā)的種子對可溶性蛋白質(zhì)的分解利用多集中在這兩個(gè)階段。25 ℃處理下穿心蓮種子可溶性蛋白質(zhì)含量在起弓階段之前逐漸升高，起弓階段后逐漸下降，說明25 ℃下種子對可溶性蛋白質(zhì)的分解利用多集中在伸長階段。30 ℃處理下穿心蓮種子吸脹階段可溶性蛋白質(zhì)含量有所升高，之后迅速下降，直到起弓階段后開始緩慢升高，說明30 ℃下種子對可溶性蛋白質(zhì)的分解利用多集中在在露白與起弓階段。20、25 ℃處理下種子可溶性蛋白質(zhì)含量與30 ℃處理下的種子在起弓階段差距最大，含量分別為0.48%、0.50%和0.11%。結(jié)果顯示，20、25 ℃處理下種子可溶性蛋白質(zhì)合成主要集中在露白與起弓階段，為伸長與長葉階段提供物質(zhì)基礎(chǔ)，與之相反，30 ℃處理種子可溶性蛋白質(zhì)合成總體較低。

2.4.2 游離氨基酸含量的變化 由圖5可知，在穿心蓮種子萌發(fā)整個(gè)過程中，游離氨基酸含量變化與可溶性蛋白質(zhì)含量變化相反，30 ℃處理下種子游離氨基酸含量，在起弓階段前隨著蛋白質(zhì)的降解而增加，隨著種子的萌發(fā)，種子內(nèi)的生理代謝活動(dòng)不斷增強(qiáng)，可溶性蛋白質(zhì)大量分解，從而使游離氨基酸含量不斷增加，為種子萌發(fā)提供保障。20、25 ℃處理下種子與30 ℃相比，呈相反趨勢，在起弓階段后游離氨基酸含量才有所增加，伸長階段后開始減小。

2.5 不同溫度下穿心蓮種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的變化

據(jù)報(bào)道，抗氧化相關(guān)酶活性的變化可間接地反應(yīng)各種代謝活動(dòng)的強(qiáng)弱及種子萌發(fā)初始階段的活化程度[12]。

2.5.1 POD活性變化 研究結(jié)果表明（圖6），穿心蓮種子萌發(fā)過程中，不同溫度下干種子到露白階段種子POD活性緩慢上升，隨著種子的萌發(fā)生長，露白階段后種子POD活性迅速增加，到伸長階段酶的活性達(dá)到最高，分別為77.68、88.52、59.30 U/（g·min），25 ℃處理下POD活性最高，其次是20 ℃處理，30 ℃處理的種子POD活性最低，表明25 ℃對于穿心蓮種子伸長階段POD活性有促進(jìn)作用。

2.5.2 SOD活性變化 從圖7可知，穿心蓮種子的萌發(fā)從吸脹到露白階段，30 ℃處理下種子的SOD活性迅速上升，由122.46 U/g上升到454.10 U/g，之后SOD活性逐漸下降，而20、25 ℃處理下種子在露白階段雖然SOD活性有所上升，但遠(yuǎn)小于30 ℃處理，分別為194.12、208.93 U/g。在伸長階段，20、25 ℃處理下種子SOD活性達(dá)到最大，分別為382.38、428.72 U/g，高于30 ℃處理的294.92 U/g。

2.5.3 CAT活性變化 圖8結(jié)果顯示，30 ℃處理下穿心蓮種子CAT活性在吸脹到露白階段迅速上升并在露白階段達(dá)到最大，為454.94 U/（g·min），之后活性逐漸降低。而20、25 ℃處理下種子吸脹到露白階段雖然CAT活性迅速上升，但仍小于30 ℃處理，分別為275.96、337.68 U/（g·min）。20、25 ℃處理下種子的CAT活性在伸長階段達(dá)到最高，分別為333.52、466.54 U/（g·min），高于30 ℃處理下種子CAT活性，之后迅速降低。與SOD活性變化相比，不同溫度下種子CAT活性變化在萌發(fā)過程中不同階段的趨勢相似。

3 小結(jié)與討論

種子在萌發(fā)期間所需要的養(yǎng)料和能量主要來自其儲(chǔ)藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和利用[13]。淀粉、粗脂肪、可溶性糖含量的變化，反映了種子內(nèi)可利用態(tài)物質(zhì)和能量的供應(yīng)基礎(chǔ)[14]。種子中貯藏的蛋白質(zhì)是氮源的供應(yīng)者，可以分解為可溶性蛋白，進(jìn)而水解成氨基酸，為種子萌發(fā)提供氮源[11]。水分是限制種子萌發(fā)的主要因素，只有在足夠的水分條件下，種子才會(huì)萌發(fā)[15]。因此，通過對這些指標(biāo)的分析，可以推斷體內(nèi)多種生理反應(yīng)的機(jī)制。

本研究通過對穿心蓮種子萌發(fā)過程中能量物質(zhì)的分析，20、25 ℃處理下種子在伸長階段淀粉迅速下降的同時(shí)，可溶性糖的含量上升，表明在20、25 ℃處理下種子的淀粉在伸長階段大量分解轉(zhuǎn)化為可溶性糖提供能量。在整個(gè)萌發(fā)過程中，20、25 ℃處理下種子粗脂肪含量均高于30 ℃處理，說明20、25 ℃處理種子在整個(gè)階段對粗脂肪的分解利用要小于30 ℃。而穿心蓮種子萌發(fā)過程中，游離氨基酸含量變化與蛋白質(zhì)含量變化相反，說明游離氨基酸與蛋白質(zhì)互相轉(zhuǎn)化，以便促進(jìn)種子的正常萌發(fā)。

通過測定穿心蓮種子3種抗氧化酶在各階段的活性發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)過程中主要抗氧化酶POD、SOD和CAT活性逐漸升高，從而為種子內(nèi)物質(zhì)代謝等生理活動(dòng)的正常進(jìn)行提供基礎(chǔ)，但是比較3個(gè)溫度下的穿心蓮種子抗氧化酶的活性變化發(fā)現(xiàn)，20、25 ℃處理下3種抗氧化酶的活性均是在伸長階段達(dá)到最大，且25 ℃處理下種子各階段的酶活均大于20 ℃處理下種子。

綜上所述，穿心蓮種子在極限萌發(fā)溫度20、30 ℃下，伸長階段前氨基酸與蛋白質(zhì)的相互轉(zhuǎn)化、3種抗氧化酶的活性均低于25 ℃處理下種子。而在整個(gè)萌發(fā)階段，25 ℃處理下種子對粗脂肪的分解利用均小于20、30 ℃處理下種子，可以得出25 ℃處理種子在伸長階段后對各儲(chǔ)藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用要高于20、30 ℃處理。在種子培養(yǎng)過程中，25 ℃處理種子的萌發(fā)速度與長勢均好于其他2種溫度，因此，綜合各個(gè)因素考察，在穿心蓮種子的萌發(fā)過程中推薦以25 ℃為宜。

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