鹽堿土高效固氮蠶豆根瘤菌的篩選

摘要：通過對云南玉溪澄江大白豆（宿主植物）的根瘤采集及根瘤菌的分離純化，獲得了36株蠶豆（Vicid faba Linn）根瘤菌。為進一步探討所得根瘤菌的結瘤固氮能力，采用土壤盆栽的方法，將這些根瘤菌回接到蠶豆小青皮上。植物生長70 d以后，觀察生長狀況，綜合株高、地上部分干重、結瘤數等生長指標，篩選出2株高效固氮根瘤菌菌株Hbu610041和Hbu610055，為蠶豆的實際生產準備了根瘤菌接種菌株資源。

關鍵詞：根瘤菌；蠶豆（Vicid faba Linn）；固氮；篩選；鹽堿土

中圖分類號：Q939.96 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-3846-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.010

Abstract： The nodules have been collected from Vicid faba Linn var. Chengjiangdabaidou（host plant） in Yuxi，Yunnan and 36 rhizobial strains were isolated and purified. To further investigate the nitrogen-fixing efficiency of the acquired rhizobia， these rhizobia were inoculated to V. faba Linn var. Xiaoqingpi， and planted in pot with soil. The plants were harvested 70 days later，and the plant height，the shoot dry weight and the number of nodules was determined. Taking the three factors into consideration， two strains， Hbu610041 and Hbu610055， with the higher nitrogen-fixing efficiency，were screened out and laid the agents foundation for V. faba production.

Key words： rhizobia； Vicid faba Linn； nitrogen-fixing； screening； saline-alkaline soil

蠶豆（Vicid faba Linn）又稱為胡豆、佛豆，為一年生（春播）或兩年生（秋播）草本植物，糧食、蔬菜和飼料、綠肥兼用作物；具有很高的營養(yǎng)價值，蛋白質含量在30%以上[1]，具備人體需要的8種必需氨基酸。與大豆相比，具有高蛋白質、高淀粉、低脂肪的特點，加工產品如蠶豆罐頭、五香蠶豆等，深受人們青睞。蠶豆根系發(fā)達，具有較強的抗旱性，耐寒、耐鹽堿，適種范圍廣，其中有不少種類適宜在西部地區(qū)推廣生產。蠶豆的主要品種有臨蠶5號、臨蠶201、臨夏馬牙等，種植規(guī)模四川最多，次為云南、湖南、湖北等省。據聯(lián)合國糧食農業(yè)組織統(tǒng)計[2]，2013年中國的蠶豆產量為140萬t，占世界蠶豆產量的40%。

蠶豆可與根瘤菌形成共生根瘤，能增強作物本身及土壤的氮素營養(yǎng)，其根系不僅能將不易被利用的磷鉀元素轉化為有效態(tài)，而且在生長過程中分泌有機酸[3]，從而提高土壤肥力。此外，接種蠶豆根瘤菌可以提高蠶豆與其他禾本科糧食作物套種的生產效益[4，5]。蠶豆根瘤菌的類群主要為快生根瘤菌屬，是豌豆根瘤菌的一個生物型[6]；蠶豆根瘤菌主要隸屬種群豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum bv viciae）[7]，少數為菜豆根瘤菌（R. etli）[8]、蠶豆根瘤菌（R. fabae）[9]和拉蓋爾根瘤菌（R. laguerreae）[10]；中國的蠶豆根瘤菌具有極大的表型多樣性和遺傳多樣性[6]，Tian等[7]還通過同源性分析將中國的蠶豆根瘤菌分為亞熱帶的秋播型、溫帶的春播型及云南省的春秋播均可的中間型三大類。

根瘤菌具有較強的宿主專一性，只有接種與豆科植物相匹配的根瘤菌才能有效提高植物的產量；不同根瘤菌菌株之間的固氮效率也不相同，有些甚至抑制阻礙植物的生長[11]；并且根據陳文新[12]多年的研究，認為如果某一地區(qū)長期未種植過某一豆科植物，則該地區(qū)的土壤中幾乎沒有與之共生的根瘤菌；因此通過篩選以獲得與植物互作且高效固氮的最佳“伴侶”，預先對豆科種子進行根瘤菌菌劑拌種，提高植物的固氮效率，對農業(yè)生產具有重要意義。目前，關于蠶豆根瘤菌的高效固氮菌株得到了較多的研究，王文麗等[13]、刁治民[14]、Xu等[15]通過分離得到了一些共生固氮能力較強的蠶豆根瘤菌，并對植物株高、莖葉干重及含氮量、根瘤數、根瘤質量和固氮酶活性等生理指標進行了比較，獲得了一些固氮效率高的株菌，但同時也發(fā)現(xiàn)了有些根瘤菌不能結瘤固氮或固氮效率較低。

本研究中的澄江大白豆是云南優(yōu)良豆種之一，產量可達3 000～4 500 kg/hm2，高的甚至可超過6 000 kg/hm2[16]。本研究從澄江大白豆根瘤內分離純化出根瘤菌，再將其回接到小青皮蠶豆，通過測定小青皮蠶豆的株高和干重，篩選出具有高效固氮能力的根瘤菌。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

宿主植物來自云南玉溪的澄江大白豆；回接植物為小青皮蠶豆，由華中農業(yè)大學資源學院耿明建教授提供。

供試土壤為鹽堿土（滄州黃驊）和沙子的混合物，其體積比為4∶1，每盆0.5 kg混合沙土，裝盆之前要經過80目的篩子篩過。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集及蠶豆根瘤菌的分離純化 以云南玉溪市為采集地點進行蠶豆的根瘤采集，按照平板劃線法[17]進行根瘤菌的分離和純化。具體操作流程如下：挑選根瘤用無菌水沖洗干凈并浸泡2～3 h；75%乙醇處理5 min，5% NaClO處理1 min，無菌水多次沖洗根瘤（5次以上）；將消毒后的根瘤放入無菌平板內，用無菌竹簽將根瘤壓破使根瘤內的菌液流出，蘸取根瘤懸液接種于YMA培養(yǎng)基平板上；28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)至長出單菌落。從平板上挑取單菌落進行革蘭氏染色并用油鏡鏡檢。挑選革蘭氏陰性染色，桿狀，得到純培養(yǎng)物后接種于YMA培養(yǎng)基斜面，待其長滿菌苔，部分斜面用甘油管保存，其余部分4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 結瘤試驗 ①結瘤植物蠶豆小青皮種子的萌發(fā)。挑選光滑、飽滿、粒大的小青皮蠶豆種子，先用濃硫酸處理10 min，再用清水洗5次以上，消毒完畢后，將種子置于含無菌水和濾紙的培養(yǎng)皿（直徑15 cm）中，置于20 ℃，使其避光發(fā)芽，每天換1次無菌水（在水管下沖洗種子，搖晃培養(yǎng)皿）。②蠶豆小青皮的根瘤菌侵染試驗。3 d后，發(fā)出的蠶豆芽長至1 cm，從中挑選發(fā)芽較好的蠶豆種子，5個一組，放置于平板中。取每株菌制成的2 mL菌懸液（用無菌水）均勻滴在蠶豆種子上，使根瘤菌侵染30 min。然后將接種好的蠶豆種子轉接到塑料盆中（10 cm×15 cm），種植深度2 cm，用塑料薄膜封好。每個菌株號做5次重復。種子發(fā)芽后剪破薄膜并定期澆水，觀察植物生長情況。大約70 d后，測每株植株的株高和干重，記錄結果。

1.2.3 蠶豆生長指標的測定 植物生長70 d后進行收獲。首先觀察記錄植物莖的分枝數；對植物的株高進行統(tǒng)計，以第一片真葉著生處為起點，以植株的最高點為終點進行測量記錄；剪取植株地上部分裝入信封，做好標記，放入烘箱中105 ℃殺青2 h，再65 ℃烘干至恒重；用水輕輕沖洗根部的土壤，統(tǒng)計根瘤數，一個重復統(tǒng)計5株。

1.2.4 數據處理 通過統(tǒng)計軟件SPSS對試驗數據進行單因素方差分析（One-way ANOVO）；在滿足方差齊性的情況下，利用Tukey檢驗進行多重比較，確定各因子內部不同水平平均值之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 分離純化得到的蠶豆根瘤菌菌株

共分離純化得到36株根瘤菌，選取部分菌株回接小青皮蠶豆。

2.2 回接植物蠶豆小青皮的地上部分株高、干重和結瘤數

利用SPSS軟件對植物株高、地上部分干重和結瘤數進行單因素方差分析，結果見表1。由表1可以看出，接種不同蠶豆根瘤菌菌株對株高和結瘤數影響顯著（P<0.05），對干重的影響極顯著（P<0.01）。

通過均值分析，獲得了接種根瘤菌菌株澄江大白豆的地上部分干重、株高和結瘤數的數據（摘取了16株的數據），如表2所示。從表2可以看出，在36株供試菌株中，對蠶豆地上部分干重方面影響最為顯著的菌株為Hbu610045，植物干重達1.963 g/株，與對照組相比增加61.17%，其次為Hbu610041和Hbu610055，均顯著高于對照組，分別比對照組增加58.46%和58.05%。接種不同蠶豆根瘤菌對蠶豆的株高影響顯著，其中表現(xiàn)最突出的為菌株Hbu610066，株高為52.57 cm，比對照組增加23.69%；此外，菌株Hbu610062、 Hbu610055、 Hbu610046、 Hbu610063、Hbu610061、Hbu610041等6株菌株表現(xiàn)優(yōu)良，比對照組增加13.29%～16.09%；但接種菌株Hbu610037、Hbu610039和Hbu610036的植株株高低于對照組。在結瘤方面，除對照組外，其余植株的結瘤數在13.6～27.6個/株之間，數目較多的為菌株Hbu610066、Hbu610041、Hbu610055，均顯著高于對照組。接種菌株Hbu610066的蠶豆干重僅為1.558 g/株，而接種菌株Hbu610041和Hbu610055的蠶豆結瘤數雖不及Hbu610066，地上部分干重積累卻在眾多菌株中表現(xiàn)突出，說明這兩株菌不僅易侵染蠶豆植株[13]，而且能夠提高固氮效率及增強光合作用。

通過測定分析植物的以上3項生理指標，發(fā)現(xiàn)36株供試菌株中，有2株高效固氮菌，分別為Hbu610041和Hbu610055，地上部分干重分別為1.930 g/株和1.925 g/株，分別比對照組增加58.46%和58.05%；株高分別為48.15 cm和49.24 cm，分別比對照組增加13.29%和15.86%；結瘤數分別為27.5個/株和27.4個/株。這兩株菌表現(xiàn)優(yōu)于其他菌株，固氮活性高，可考慮用于農業(yè)生產中的菌劑應用。

2.3 回接植物蠶豆小青皮的分枝數

由表3可以看出，菌株Hbu610064、Hbu610061、Hbu610057的分枝數較多，分別為2.8、2.6、2.6個/株，表現(xiàn)突出。通過SPSS軟件分析，這3株菌與對照組差異均達顯著水平，分枝數明顯大于其他試驗組。綜合表2的結果分析發(fā)現(xiàn)，接種這3株菌的植株在株高方面表現(xiàn)良好，但在干重和結瘤數方面表現(xiàn)一般；而接種菌株Hbu610041和Hbu610055的植株，分枝數分別為1.8個/株和2.2個/株，表現(xiàn)良好，且植株性狀表現(xiàn)也較好，因此可作為制備菌劑的候選菌株。

3 討論

據統(tǒng)計，中國的鹽堿地面積約為1億hm2，占全世界鹽堿地面積的1/10[18]，但開發(fā)利用的僅占1/5[19]，鹽堿地的土壤堿性重、鹽分高，嚴重影響農作物的正常生長和產量。因此治理和修復鹽堿地，能很好地促進中國農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，改良鹽堿地的技術有傳統(tǒng)的物化措施、水利工程措施和農業(yè)措施等，其中利用生物技術改良具有投資少、效果好、穩(wěn)定生態(tài)平衡的優(yōu)勢[20]。肖克飚等[21]對耐鹽植物進行了相關研究；也有許多學者利用微生物菌劑對鹽堿土進行改良[22]；Abd-Alla等[23]篩選出耐堿的蠶豆根瘤菌，并將其接種蠶豆，將其種植在pH 7.5～9.0的土壤中，發(fā)現(xiàn)蠶豆的結瘤數、干鮮重和固氮酶活及根瘤豆血紅蛋白質均高于對照組，而且倘若侵染根瘤菌的同時侵染叢枝菌根真菌，蠶豆的生長效果更好。

本研究以河北滄州黃驊鹽堿土為供試土壤，種植蠶豆，并接種相應蠶豆根瘤菌，通過測定植物的干重、株高、結瘤情況并結合蠶豆分枝數分析，發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌后蠶豆的生長狀況普遍較好。綜合地上部分干重、株高、結瘤狀況及分枝這4項指標考慮，菌株Hbu610041和Hbu610055表現(xiàn)突出，對蠶豆的生長具有促進作用。但也有一些菌株不能很好地改善植株生長狀況，比如菌株Hbu610065，對植物干重的影響不大；接種菌株Hbu610037和Hbu610036的植株株高低于對照組，可能是由于菌株Hbu610037和Hbu610036的固氮效率低，與植物互作后產生的根瘤中無效根瘤較多[24]；有些菌株能明顯增加結瘤數，但隨之代謝消耗的物質能量也會增加，進而導致其不能很好地發(fā)揮對植物的促生作用，例如菌株Hbu610066。

近年來，Saidi等[25]通過16S rDNA-PCR分析了從蠶豆根瘤分離的微生物，發(fā)現(xiàn)其中有45%的微生物與Rhizobium leguminosarum USDA2370T極為相似，同源性達99.34%，可見根瘤菌在根瘤內生菌群中占有重要地位。豆科植物接種根瘤菌一方面可以改善土壤營養(yǎng)，增強植物抗逆性，提高農作物產量；另一方面又可以降低化肥的施用量，減少環(huán)境污染，有助于早日實現(xiàn)中國提出的化肥使用量零增長的目標。此外，作物的殘枝敗葉還可以優(yōu)化鹽堿土壤中微生物群落結構（解鉀菌和芽孢桿菌數量增加等），為下一年的作物生長提供營養(yǎng)，實現(xiàn)良性循環(huán)。本研究中蠶豆根瘤菌菌株Hbu610041和Hbu610055的表現(xiàn)整體上優(yōu)于其他菌株，固氮活性高，可優(yōu)先考慮用于農業(yè)生產中菌劑的制備。

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