烤煙根際土壤產普魯蘭酶菌株的分離鑒定及產酶活性

摘要：通過以支鏈淀粉為碳源的初篩分離培養和以普魯蘭糖為惟一碳源的鑒別復篩，從濃香型烤煙根際土壤中分離到一株具有產普魯蘭酶活性的菌株，編號為CLM2。通過形態特征、生化特性和16S rDNA序列分析及系統發育進化樹的構建，確定CLM2隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），暫命名為Bacillus sp. CLM2。在以玉米淀粉為碳源、35 ℃、180 r/min條件下的發酵歷程中，發酵54 h時普魯蘭酶活力達到最大值，為4.3 U/mL。

關鍵詞：植物內生菌；分離；普魯蘭酶；16S rDNA；烤煙根際土壤

中圖分類號：Q939.9；Q949.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-3856-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.012

Abstract：Strain CLM2 with function of pullulanase-producing was isolated from rhizosphere soil of tobacco by using amylopectin and pullulan respectively as the sole carbon source. Based on standard morphological， physiological properties， 16S rDNA sequence and the construction of phylogenetic tree， the CLM2 belongs to the genus Bacillus，and temporarily named Bacillus sp. CLM2. After fermentation for 54 h， its enzyme activity reached a maximum of 4.3 U/mL under the condition of 35 ℃，180 r/min by using corn starch as the sole carbon.

Key words：plant endophy； isolation； pullulanase； 16S rDNA； rhizosphere soil of tobacco

普魯蘭酶（Pullulanase，EC3.2.1.41）屬于淀粉酶類的脫支酶（Isoamylase，EC3.2.1.9）范疇，它是水解支鏈淀粉、普魯蘭糖、極限糊精的一種α-1，6糖苷鍵酶，能使支鏈淀粉脫支形成長短不一的直鏈淀粉或麥芽糖低聚物，催化產物以麥芽糖寡糖為主[1]。而自然界的淀粉大多含有80%的支鏈淀粉[1-3]，所以普魯蘭酶是高效利用淀粉不可缺少的關鍵酶之一，在食品與醫藥行業具有重要地位，一直是微生物功能酶研究的熱點[2-5]。但不同來源的普魯蘭酶往往對底物作用專一性會存在差異，因此，對具有普魯蘭酶活性菌株的篩選分離工作從未停止過。世界范圍內除了丹麥NOVO公司通過開發酸性普魯蘭芽孢桿菌生產的普魯蘭酶外[2]，文獻報道的大多數野生菌株發酵產酶活性普遍較低，即使是通過克隆技術實現的普魯蘭酶基因外源表達所構建的工程菌株[6-8]也往往達不到工業化生產的發酵產酶效果。所以，持續分離篩選活性較高的產普魯蘭酶菌株仍然具有很強的現實意義。

植物內生菌是一個巨大的遺傳多樣性寶庫，豐富多樣的植物為內生菌提供了多元復雜的生活環境，內生菌的豐富程度以及所具備的精彩紛呈的生物學特性，為微生物功能酶菌株的分離和開發提供了更多可能[9]。煙草是一種重要的傳統經濟植物，既有藥用價值，也是香煙制作原材料，中國的煙草種植面積和產量均居世界首位，已經形成了完整的產業鏈[6，7]。迄今為止，尚未見烤煙根際土壤產普魯蘭酶菌株分離鑒定的報道。基于以上背景，本研究以濃香型烤煙豫煙6號根際土為試驗材料，分離培養具有產普魯蘭酶活性菌株，旨在豐富產普魯蘭酶菌株野生資源。

1 材料與方法

1.1 材料

烤煙根際土樣：采自河南省漯河市煙草種植基地生產田。

支鏈淀粉固體分離培養基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，支鏈淀粉3 g，NaCl 5 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

普魯蘭糖鑒別培養基：蛋白胨6 g，酵母提取物4 g，NaCl 5 g，普魯蘭糖3 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

LB種子培養基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

發酵產酶培養基：玉米淀粉20 g，酵母粉10 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

所用支鏈淀粉和普魯蘭糖購自Sigma公司，其他均為國產。

1.2 方法

1.2.1 產普魯蘭酶菌株的分離 取5 g土樣，加入滅菌的45 mL去離子水中，振蕩20 min，制成10-1的土壤稀釋液，再按10倍梯度稀釋至10-6。分別取10-4、10-5、10-6稀釋梯度菌懸液50 μL涂布于支鏈淀粉固體分離培養基，恒溫培養箱中30 ℃培養48 h后，選取典型菌落連續進行3次平板劃線純化，并將純化菌種斜面4 ℃保存。

通過支鏈淀粉固體分離培養基初篩后，將初篩菌株轉接于普魯蘭糖鑒別培養基。30 ℃恒溫培養48 h，滴加盧氏碘液，將具有水解圈者確定為具有普魯蘭酶活性菌株。

1.2.2 篩選菌株的產酶活性測定 制備粗酶液，將具有水解圈菌株接種到裝有50 mL種子培養基的三角瓶中，37 ℃、160 r/min搖床培養16 h，然后取6 mL轉接于裝有75 mL產酶培養基的1 000 mL三角瓶中，相同條件下搖床培養70 h，每隔4 h取樣一次，發酵上清液即為粗酶液。采用DNS法對粗酶液進行酶活性測定，參照文獻[9]并稍作改進。

1.2.3 篩選菌株的鑒定 應用普通光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡對菌株進行形態觀察[10]；生理生化指標測定方法參照文獻[11，12]進行。

菌株的16S rDNA分析：將目標菌株接種于LB種子培養基，37 ℃、180 r/min搖床培養12 h，獲取菌液。采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit Ver. 2.0試劑盒提取ZXYG5基因組DNA。

16S rDNA PCR擴增引物：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物1492R（5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR擴增體系（20 μL）：10×Ex Taq PCR buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/mL）1.6 μL，正、反向引物（20 μmol/mL）各1 μL，DNA模板1 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL，超純水13.2 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸100 s，循環32次；72 ℃最終延伸7 min。目的片段長度為1.5 kb左右，PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver. 3.0進行膠回收，回收產物與TaKaRa pMDTM18-T Vector連接，并將重組質粒轉化于DH5α感受態細胞，37 ℃培養過夜，經藍白斑篩選，挑選陽性克隆搖菌進行序列測定（由北京奧克鼎盛生物科技有限公司完成）。

將測序獲得的16S rDNA序列提交NCBI數據庫進行相似性比對，采用MEGA6.06軟件構建Neighbor-Joining系統發育進化樹。菌株鑒定參照文獻[13，14]進行。

2 結果與分析

2.1 產普魯蘭酶菌株的分離結果

通過支鏈淀粉固體分離培養基的分離培養和普魯蘭糖鑒別培養基的鑒別復篩，并經過劃線純化，獲得一株水解圈大而顯著的菌株（圖1），編號為CLM2，確定其具有產普魯蘭酶活性，為研究菌株。

2.2 菌株CLM2的產普魯蘭酶活性測定

對CLM2菌株采用DNS法進行普魯蘭酶活性測定，結果顯示，在ZXYG5菌株產酶歷程中，發酵54 h時，普魯蘭酶活性達到最高4.3 U/mL，進一步說明該菌株具有較強的產普魯蘭酶活性（圖2）。可作為下游誘變育種、發酵條件優化等研究的良好出發菌株。

2.3 菌株CLM2的多項分類鑒定

2.3.1 菌株CLM2的形態特征 菌株CLM2為桿型細菌，大小（0.7～1.2） μm×（1.2～3.2） μm，無莢膜，能運動；好氧，在LB平板上35 ℃培養48 h，菌落近圓形，邊緣不整齊，直徑1～2 mm，表面粗糙，扁平。菌落淺灰色，生長5 d以上后，中心亞緣區域略有紅色（圖3a）；芽孢橢圓形，位于中間或次極端（圖3b）。掃描電鏡下可見典型桿型菌體，兩端鈍圓，具鞭毛（圖3c）。

2.3.2 菌株CLM2的生理生化鑒定 對菌株CLM2進行的生理生化指標測定結果（表1）表明，菌株CLM2被初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus）[9，10]。

2.3.3 菌株CLM2的16S rDNA鑒定 菌株CLM2的16S rDNA序列PCR擴增條帶清晰，如圖4所示。

將目的條帶進行膠回收，與質粒連接后轉化感受態大腸桿菌，經過藍白斑篩選，對陽性克隆進行測序。測序獲得的CLM2菌株16S rDNA序列長度為1 515 bp。將序列提交NCBI（National Center for Biotechnology Information）的blast程序進行在線相似性比對，并選取相似度高的菌株序列構建CLM2菌株的系統發育進化樹。結果（圖5）顯示，菌株CLM2與芽孢桿菌屬（Bacillus）的5個菌株聚在同一分支上，而且bootstrap值達到100%，說明菌株CLM2基于16S rDNA序列的系統歸屬具有較高的可信度。綜合菌株的形態特征、生理生化特性和分子鑒定結果，將菌株CLM2歸為芽孢桿菌屬，暫命名為Bacillus sp. CLM2。

3 小結與討論

文獻報道的產普魯蘭酶菌株資源類群主要有Bacillus flavocaldarius、 B. stearothermophilus、 B. thetaiotaomicron、 B. Licheniformis、 B. Naganoensis、Bacillus sp. KSM-1378、Caldicellulosiruptor saccharolyticus、 Fervidobacterium pennavorans、 Kiebsiella aerogenes、 K. pneumoniae、 Thermotoga maritima、Thermoanaerobacter ethanolus、 Thermoactinomyces ethanolicus等，但得到工業化開發利用的僅有B. Acidopullulyticus及重組B. Deramificans等極少數菌[1-4，15，16]。出現這種情況的主要原因一個是產普魯蘭酶活性較高的野生菌株資源有限，傳統誘變育種缺少良好的出發菌株；另一個原因是通過基因操作構建的工程菌，多數發酵產酶效果達不到工業化生產要求。所以，從不同材料中分離培養更多發酵型產酶菌株，對普魯蘭酶來說顯得更為迫切。烤煙根際土壤是一個較為特殊的微生物生境，可能具有較為特殊生理活性的菌株。在發酵條件沒有優化的情況下，本研究從烤煙根際土壤分離獲得的CLM2菌株的產酶活性達到4.3 U/mL，與有些文獻報道[17，18]的野生菌株相比，具有一定的優勢，豐富了產普魯蘭酶菌株常規誘變育種和全基因組育種的遺傳資源。CLM2菌株經過本研究的多項分類鑒定，在系統發育上歸屬于芽孢桿菌屬，而芽孢桿菌屬是產α-淀粉酶、普魯蘭酶、脂肪酶、蛋白酶等功能酶的重要屬之一，成功構建工程菌株的案例也較多，這為菌株CLM2的下游研究提供了便利。同時，本研究也為更多產普魯蘭酶菌株的分離篩選提供了有益的啟示。

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