產幾丁質酶細菌的篩選、鑒定及酶學性質研究

摘要：采用膠體幾丁質平板產生透明圈法，從竹林附近的土壤中分離得到一株高產幾丁質酶的優良菌株，以膠體幾丁質為反應底物，對其所產的幾丁質酶粗酶性質進行了初步研究。結果表明，該酶最適pH 7.5，在pH 6.5～9.5的緩沖液中放置12 h后，殘余酶活仍在60%以上，在pH 7.0～8.5的緩沖液中殘余酶活仍在80%以上，說明該酶在中性和堿性條件下具有較好的穩定性；該酶在30 ℃時酶活最高，在低于60 ℃的處理條件下殘余酶活仍在80%以上，且80 ℃處理后仍有37%的殘余酶活，說明該酶的熱穩定性較好；配制蟹殼培養基發酵該菌，發現該菌能直接降解蟹殼產生殼寡糖，且每克蟹殼降解后可產生5.3 mg還原糖。通過16S rDNA基因序列比對，鑒定該菌為芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。

關鍵詞：幾丁質酶；酶學性質；菌種鑒定；蟹殼降解

中圖分類號：Q939.97 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-3887-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.020

Abstract： A bacterium producing high chitinase was isolated from soil around bamboo forest by method of colloidal chitin plate. The characteristics of the crude chitinase that produced by this strain was studied by using colloidal chitin as the substrate. The results showed that the optimum pH of the enzyme was 7.5. The crude enzyme still had 60% of the highest activity after overnight incubation at pH 6.5～9.5， especially it still had 80% of the highest activity in the buffer of pH 7.0～8.5，which indicated that the enzyme was very stable under neutral or alkaline conditions. The crude chitinase displayed the maximum activity at 30 ℃. After incubation below 60 ℃ for 30 min，it remained more than 80% of the highest activity. And after incubation at 80 ℃ for 30 min，it still had 37% of the highest activity which indicated the chitinase also had better thermal stability. After cultivation at crab shell medium，the bacteria could directly degradate crab shell to chitosan oligosaccharide，producing 5.3 mg reducing sugar per gram of crab shells. The strain was identified as Bacillus sp. by measuring its 16S rDNA sequence.

Key words： chitinase； enzymatic properties； strain identification； crab shells degradation

幾丁質是一種廣泛分布于自然界中的生物多聚物，在所有天然聚合物中儲量占第二位，僅次于纖維素[1]。幾丁質酶（Chitinase，EC3.4.1.14）可催化水解幾丁質的β-1，4-糖苷鍵生成幾丁聚糖和幾丁寡糖[2]。幾丁質的降解產物幾丁寡糖、殼低聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖可以廣泛應用于生物醫藥、食品、化妝品、紡織、農業等領域，具有普遍的生物學活性及可觀的經濟效益[3-7]。

海產品加工產生的蝦殼、蟹殼等下腳料是富含幾丁質的廢棄物，這些未經處理的下腳料，不僅造成資源浪費，而且污染環境。采用幾丁質酶水解處理，不僅可以有效處理廢棄物保護環境，而且還可以變廢為寶，生產高附加值的殼寡糖等系列產品。

自從Benecke首次報道分離到幾丁質酶產生菌以來，發現在微生物中很多細菌、放線菌、真菌、酵母及某些病毒都能夠產生幾丁質酶[8，9]。本試驗從土壤中篩選出一株產幾丁質酶的菌株，經16S rDNA測序，對該菌進行鑒定，并對其酶活和酶學性質進行了測定，為酶法降解幾丁質制備幾丁寡糖以及該酶在其他領域的應用提供理論和實踐的指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 采自武漢設計工程學院校園竹林處、污水處理池附近和湯遜湖邊表層5～10 cm土壤以及埋有蝦殼30 d土壤，分離出產幾丁質酶的菌株。

1.1.2 培養基 富集培養基（1 L，pH 7.0）：蛋白胨 1 g、酵母膏1 g、NaCl 0.5 g；初篩平板固體分離培養基（1 L，pH 7.0）：蛋白胨1 g、酵母膏1 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂15 g、3%膠體幾丁質80 mL；發酵培養基（1 L，pH 7.0）：蛋白棟0.5 g、酵母膏0.5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、3%膠體幾丁質80 mL；蟹殼發酵培養基（1 L，pH 7.0）：蛋白胨0.5 g、酵母粉0.5 g、K2HPO4 0.7 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蟹殼20 g。

1.1.3 膠體幾丁質的制備 片狀幾丁質5.0 g、濃磷酸40 mL置于50 mL小燒杯中，用保鮮膜將杯口封好，28 ℃放置24 h。24 h后取出，5 000 r/min離心10 min，取上清液，加NaOH和去離子水調pH至7.0， 5 000 r/min離心10 min，取沉淀即為膠體幾丁質。

1.2 方法

1.2.1 產酶菌種篩選 將待測樣品（土樣）加無菌生理鹽水并用玻璃珠打散，靜置2 min后取上清液加入富集培養基中，在37 ℃恒溫搖床上培養24 h。將富集后的菌液稀釋成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8系列稀釋菌液，分別均勻涂布在初篩平板固體分離培養基中，放入37 ℃的恒溫培養箱中培養36 h，然后用0.1%剛果紅染色20～30 min，再用1 mol/L NaCl脫色10～15 min，挑選能產生透明圈的單菌落。

1.2.2 酶活的測定 取出初篩得到的菌株，接種至液體發酵培養基中，置于37 ℃的恒溫搖床上振蕩培養48 h后，測定發酵液的酶活。1 mL酶液在37 ℃、pH 7.0的條件下每分鐘產生相當于l μmol N-乙酰氨基葡萄糖還原糖所需的酶量定義為單位酶活。幾丁質酶酶活的測定方法[10]如下：①取5 mL搖瓶培養液經5 000 r/min離心10 min；②取0.5 mL上清液，加入1 mL Mcllvaine緩沖液、0.5 mL 3%膠體幾丁質，于37 ℃水浴30 min，然后沸水浴10 min，取1 mL 4 000 r/min離心5 min，加0.5 mL DNS試劑終止反應；③沸水浴5 min立刻冷卻，加入4 mL去離子水后測OD540 nm；④以N-乙酰葡萄糖含量為橫坐標，光密度OD為縱坐標繪制標準曲線，用空白管作零點。

1.2.3 酶學性質的測定

1）pH對酶活性的影響。以0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L檸檬酸配制pH 3.0～8.0梯度緩沖液，以0.2 mol/L NaOH和0.2 mol/L Gly配制pH 8.5～10.0梯度緩沖液，按照上述標準方法測定酶活，根據不同pH緩沖液的吸光值，測定酶的最適反應pH。

2）溫度對酶活性的影響。以最適pH緩沖液配制溶度為3%膠體幾丁質底物，按照標準曲線測定方法測定在不同溫度下的酶活。確定酶反應的最適溫度。

3）酶的pH穩定性。各取1 mL酶液于pH 3.0～10.0的緩沖液中4 ℃放置12 h。以最適pH緩沖液配制3%膠體幾丁質底物測定活性，以未用緩沖液處理的酶液的酶活為100%，計算相對酶活。

4）酶的熱穩定性。在確定酶的最適pH的前提下，以氫氧化鈉、甘氨酸為底物緩沖溶液調節pH為最適pH，各取1 mL的原酶液放入30～80 ℃的水浴鍋中保溫30 min，然后再加入最適pH配制的3%膠體幾丁質的底物，在最適溫度下測定酶活，以未處理的酶液的酶活為100%，計算相對酶活。

1.2.4 菌株降解蟹殼能力的測定 取蟹殼發酵培養基50 mL分裝至250 mL的錐形瓶中，按1%接種量接種后置于37 ℃搖床振蕩培養，以未接種的培養基作為空白對照，測定培養15 d后發酵上清液的還原糖。

1.2.5 產酶菌株的初步鑒定 采用菌體直接擴增16S rDNA的方法[11]。PCR擴增引物選用16S rDNA細菌通用引物27f/1492r（上游引物5′-AGAGTTTG ACCTGGCTCAG-3′；下游引物5′-TACCTTGTTACG ACTT-3′）。反應體系：25 mmol/L MgCl2 5 μL，10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L dNTP 2 μL，上下游引物各1 μL（濃度2 μmol/L），模板DNA 1 μL，Taq酶 （5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 12.25 μL，總體系為25 μL。PCR反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，共30個循環。PCR產物采用試劑盒（Axyprep DNA Gel Extraction K it Axygen Biosciences）純化后送至深圳華大基因科技有限公司進行測序，將測序結果同GenBank數據庫的基因序列進行比對，以確定該菌類型。

2 結果與分析

2.1 產酶菌株的篩選

將富集培養的細菌經過梯度稀釋后接種到篩選培養基上，篩選出7株可以產透明圈的菌株分別命名為1、2、3、4、5、6、7。測定7株菌的菌落直徑以及透明圈直徑和菌落直徑比，結果如表1所示，1號菌的透明圈與菌落直徑比較大。在幾丁質平板上，菌落周圍形成的透明圈除與菌株產酶水平相關外，還與菌株分泌的幾丁質內切酶與外切酶比例相關，所以不能僅以菌落周圍透明圈大小判斷菌株的產酶能力，篩選時必須綜合考慮透明圈大小、明亮程度、菌落大小以及菌落下培養基的液化程度[12]。因此，對所選取的7株含有透明圈的菌株進行復篩，從中選出目的菌株。

2.2 酶活測定

2.2.1 標準曲線制作 測定不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）的吸光度，繪制標準曲線如圖1所示。從標準曲線可以看出，NAG的含量和吸光度呈線性關系，回歸方程為y=1.936 9x-0.040 0，R2=0.993 8，式中，x為葡萄糖含量（μg/mL），y為OD540。

2.2.2 發酵液粗酶活 對挑選的7株含有透明圈的菌株放入發酵培養基中培養，取上清液，利用標準曲線的測定方法測定吸光值，通過計算得到的酶活如圖2所示。由表1、圖2可以看出，4號菌株的透明圈與菌落直徑比較2、5、6號菌株透明圈與菌落直徑比大，而其酶活卻較之小，由此可知，透明圈與菌落直徑比與酶活力的高低并非呈正相關。通過酶活的測定得到1號菌株的吸光值最大，表明在相同時間內，該菌株產生的酶活最大。因此選用1號菌株作為目的菌株。

2.3 酶學性質測定

2.3.1 pH對酶活性質的影響 將1號菌株放在不同pH梯度下，利用標準曲線的測定方法，測定不同溫度下的吸光度。所測結果如圖3所示，隨著pH升高，酶活力不斷升高，在pH 7.5以后開始下降。在pH 7.5～8.0時酶的活性較高，在pH 7.5時最高，所以該酶最適pH為7.5。該酶在pH<5時幾乎沒有活性，在pH>7.5活性開始下降，pH為10時仍有較高的活性，說明該菌耐堿性能力較強，在中性和堿性條件下更容易產生幾丁質酶。

2.3.2 溫度對酶活的影響 將pH固定在最適pH 7.5，利用標準曲線的測定方法，測定不同溫度下的吸光度，繪制不同溫度下的酶活曲線。結果如圖4所示，該酶在20～60 ℃時活性非常高，但在30 ℃時最高，所以該酶最適溫度為30 ℃。該酶60 ℃活力下降很快，在70 ℃以后活力極小。該幾丁質酶的最適反應溫度為30 ℃，略高于蜂房芽孢桿菌產生的酶，低于黃桿菌產生的酶，據報道蜂房芽孢桿菌的酶活最適溫度為28 ℃[3]，黃桿菌的最適酶活溫度為50 ℃[2]。

2.3.3 酶的pH穩定性 酶液在不同pH緩沖液中4 ℃保存12 h后，測得殘余酶活，繪制相對酶活曲線（圖5）。由圖5可知，pH 6.5～9.5的緩沖液中放置12 h后，殘余酶活仍在60%以上，尤其是在pH 7.0～8.5的緩沖液中殘余酶活仍在80%以上，說明該酶在中性和堿性條件下非常穩定。

2.3.4 酶的熱穩定性 在最適pH條件下，通過標準曲線的測定方法，測定不同溫度下保存30 min后的酶活，繪制不同溫度下的相對酶活曲線（圖6）。由圖6可知，該酶在低于60 ℃的處理條件下殘余酶活仍在80%以上，且80 ℃處理后仍有37%的殘余酶活，說明該酶的熱穩定性較好。

2.4 產酶菌株的初步鑒定

將16S rDNA的測序結果通過Blast軟件與GenBank數據庫比對，發現該序列與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）同源性最高，達到100%，初步確定該菌為芽孢桿菌屬菌株。

2.5 菌株降解蟹殼的能力

取1 mL發酵液上清液與DNS反應，根據標準曲線計算得出，每瓶發酵液總還原糖為5.3 mg，即該菌降解1 g蟹殼產生5.3 mg還原糖。表明該菌株可以直接降解蟹殼，但降解效果不是很好。

3 小結與討論

通過平板透明圈法初篩、復篩，從土壤中獲得一株透明圈最大的1號菌株，根據菌株和菌落的形態以及革蘭氏染色，初步鑒定該菌株為紫色短桿菌，經過16S rDNA的測序，初步確定該菌為芽孢桿菌屬菌株。

本試驗中所研究的細菌產幾丁質酶的最適pH為7.5，略高于蜂房芽孢桿菌和黃桿菌，蜂房芽孢桿菌產的酶的最適pH為6.8[9]，黃桿菌產的酶的最適pH為7.0[2]。該幾丁質酶的最適反應溫度為30 ℃，略高于蜂房芽孢桿菌的酶活最適溫度28 ℃[9]，而低于黃桿菌的最適酶活溫度50 ℃[2]。

酶是一種活性蛋白，因此酶的穩定性在研究酶的過程中起重要作用，而溫度和pH是影響酶穩定性的兩個主要因素。本研究中，幾丁質酶在pH 6.5～9.5的緩沖液中放置12 h后，殘余酶活仍在60%以上，尤其是在pH 7.0～8.5的緩沖液中殘余酶活仍在80%以上，說明該酶在中性和堿性條件下非常穩定；同時該酶在低于60 ℃的處理條件下殘余酶活仍在80%以上，且80 ℃處理后仍有37%的殘余酶活，說明該酶的熱穩定性較好。眾所周知，蟹殼中幾丁質的含量很高，但是目前未見有利用菌直接降解蟹殼的報道。本研究首次將篩選的菌直接用于降解蟹殼，結果表明，該菌具有降解蟹殼的能力，但是效果不是很好。原因可能是蟹殼沒有經過任何處理，結構緊密不適合直接降解，或者培養條件不合適，沒有達到最佳降解條件，還有待于進一步的研究。

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