透明顫菌血紅蛋白基因在多粘芽孢桿菌中的克隆和表達

摘要：本研究將啟動子P43與透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin）基因（vgb）通過重疊PCR進行融合，克隆到芽孢桿菌表達載體pCM20上，將篩選得到的重組載體pCM20-vgb轉化多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）NR1，Western-Blot表明重組菌株表達了VHb蛋白，該蛋白的表達對重組菌體的生長和多粘菌素的產生均有促進作用。

關鍵詞：多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）；透明顫菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin）基因；多粘菌素

中圖分類號：Q813.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-3907-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.026

Abstract： The Vitreoscilla hemoglobin（VHb） gene（vgb） was placed under the control of the P43 promoter by overlapping extension PCR. The vgb expression cassette was cloned into the vector pCM20 which was transformed into strain Paenibacillus polymyxa NR1. The production of VHb confirmed by Western-Blot promoted the growth of the strain and improved the yield of polymyxin.

Key words： Paenibacillus polymyxa； Vitreoscilla hemoglobin （VHb） gene； polymyxin

在氧濃度比較低的環境中，透明顫菌血紅蛋白基因的表達可以促進微生物細胞胞內氧的傳輸和提高氧的利用效率。多個研究表明透明顫菌血紅蛋白（VHb）對許多宿主細胞的生長及代謝產物的生成都有明顯的促進作用。透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）已被成功克隆到多種細菌、放線菌、酵母和植物中[1-5]。該基因也被引入到很多芽孢桿菌中，如Feng等[6]將vgb基因轉入蘇云金芽孢桿菌后，低氧發酵條件下菌體數量和伴孢晶體產量分別提高了1.59倍和3.13倍。Kallio等[7]將vgb基因轉入產淀粉酶枯草芽孢桿菌后，其菌體數量和淀粉酶活力分別提高了30%和17%。

多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）能產生多種抗菌物質，如多粘菌素（Polymyxin）、粘菌素（Colistin）、環桿菌素（Circulin）、殺鐮孢菌素（Fusaricidins）等，這些物質的產生和產量與發酵培養基和發酵溫度、pH、溶氧、補料與否等條件密切相關[8]。在這些因素中，溶氧是非常重要的一個因素，且對于多粘芽孢桿菌自身菌體的生長和芽孢形成有重要影響。

多粘芽孢桿菌是一種極度好氧細菌，在發酵中后期會由于菌體密度過大而造成供氧不足，從而影響菌體的生長以及代謝產物的合成。本研究以實驗室分離得到的多粘芽孢桿菌 NR1為研究對象，嘗試在該菌中克隆表達VHb，以提高多粘芽孢桿菌中多粘菌素的產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 多粘芽孢桿菌NR1為實驗室自行篩選，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）168為實驗室保存，Escherich coli Top10購自上海生物工程股份有限公司，質粒pMD18T、pCM20、pMD18T-vgb為實驗室保存。

1.1.2 工具酶及試劑 限制性內切酶、連接酶及Taq酶均購自TaKaRa公司。抗生素及其他生化試劑均購自上海生物工程股份有限公司。

1.1.3 培養基 種子培養基（LB培養基1 L，pH 7.0）：10 g NaCl、10 g蛋白胨、0.5 g 酵母浸粉。發酵培養基（1 L，pH 7.0）：30 g淀粉、15 g葡萄糖、8 g （NH4）2SO4、1 g NaCl、1 g KH2PO4、0.2 g MgSO4、3 g CaCO3、3%玉米漿30 mL。

1.2 方法

1.2.1 引物和測序 引物合成和測序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2.2 提取、酶切、連接和轉化 芽孢桿菌總DNA的提取、大腸桿菌感受態細胞的制備，質粒的提取、酶切、連接和轉化均參照文獻[9-11]。

1.2.3 P43啟動子與vgb基因的克隆和融合 以枯草芽孢桿菌168的總DNA為模板，用引物BP43F/R擴增枯草芽孢桿菌P43啟動子，上游引物BP43F引入EcoR V酶切位點；以質粒pMD18T-vgb為模板，用引物vgbF/R擴增得到vgb基因，下游引物vgbR也引入EcoR V酶切位點。再以上述兩個片段為模板，用引物BP43F和vgbR將P43啟動子片段和vgb基因片段進行重疊PCR得到融合片段。

1.2.4 多粘芽孢桿菌的轉化 將上述方法得到的融合片段插入pCM20的EcoR V位點中，經過篩選得到重組子。將重組載體pCM-vgb電轉化多粘芽孢桿菌，在紅霉素平板上挑取多個菌落，通過PCR鑒定，挑選多個陽性菌落進行下一步的發酵研究。

1.2.5 生長曲線的測定 為檢測帶有vgb基因重組載體的導入對宿主多粘芽孢桿菌生長情況的影響，將單獨導入pCM20的對照菌株和轉化了pCM20-vgb的重組菌株用LB培養基培養過夜，然后以1%的量轉接至LB新鮮培養基中，37 ℃振蕩培養，每隔2 h取樣測定菌體OD600，繪制生長曲線。

1.2.6 發酵效價的測定 按照《中國藥典》2010版（CP2010）抗生素微生物檢定法（附錄XIA），質量檢測按照《中國藥典》2010版的規定。發酵液經12 000 r/min離心10 min，取上清液，以雙碟擴散法測定發酵效價，指示菌為大腸埃希氏菌。

2 結果與分析

2.1 vgb基因表達質粒的構建

用試劑盒提取枯草芽孢桿菌168的基因組DNA，使用引物BP43F/R擴增枯草芽孢桿菌P43啟動子，得到長為0.42 kb的片段，同時以質粒pMD18T-vgb為模板，用引物vgbF/R擴增得到長為0.44 kb的vgb基因片段，以上述兩個片段為模板，使用重疊PCR技術得到一個同時含有兩個基因的融合片段，采用酶切酶連的方式構建至pCM20載體上pCM20-vgb，經篩選鑒定后得到重組質粒pCM20-vgb（圖1）。

2.2 血紅蛋白表達分析

透明顫菌血紅蛋白分子量大小為16 kD。SDS-PAGE分析結果表明，重組菌株發酵48 h后的菌體蛋白比原始菌株在16 kD處新增加了一條蛋白帶，與預期相符合。進而用Western Blot進一步驗證該重組菌株中透明顫菌血紅蛋白基因的表達，結果（圖2）證實了SDS-PAGE的結論。

2.3 VHb的表達對重組菌株生長發酵的影響

分別在正常供氧和貧氧兩種條件下測定了重組菌株和原始菌株的生長曲線（圖3），在正常供氧情況下顯示在發酵的前半階段（24 h以前），兩者的生長速率、生物量積累速率基本一致。原始菌株從30 h后就快速進入穩定期，36 h左右菌體密度達到最大值，40 h后菌體開始大量降解，48 h左右全部形成了芽孢。作為對比，重組菌株大概在40 h左右進入穩定期，44 h左右菌體密度達到最大值，48 h后菌體開始大量降解，54 h左右全部形成芽孢。通過計數，雖然重組菌株的發酵周期要長一些，但是其芽孢形成數與原始菌株相當，都在6億/mL左右，表明了該基因的表達對于芽孢形成的改善作用不大。與此對應的是在貧氧條件下，原始菌株較快進入穩定期，18 h左右即進入穩定期，24 h菌體密度達到最大，35 h時開始大量降解；重組菌株在此條件下表現稍好一些，在22 h進入穩定期，28 h密度達到最大，38 h時開始大量降解。由此可見，該菌可以在缺氧條件下有效延遲和延長其穩定生長期，這對于今后將該菌株用于發酵具有重要的意義。

2.4 VHb的表達對于重組菌株多粘菌素產量的影響

將重組菌株和原始菌株分別在正常供氧和貧氧條件下搖瓶培養一段時間后，測定多粘菌素的產量。結果（圖4）顯示，無論是在正常供氧還是貧氧條件下，多粘菌素的產量都得到了提高。在正常供氧條件下，重組菌株產量比原始菌株提高了24.9%；在貧氧條件下重組菌株產量比原始菌株提高了31.0%。

3 小結與討論

VHb蛋白已被證明了能在多種宿主中進行表達且能顯著提高相關代謝產物的產量。本研究成功構建了含有vgb基因的表達載體，并將其電擊轉化多粘芽孢桿菌NR1中實現了VHb的表達。VHb的表達明顯提高了多粘芽孢桿菌在低溶氧發酵條件下的生物量，同時也提高了多粘菌素的產量。因此，vgb基因的表達成為解決供氧限制的一種新方法。該基因的應用可以降低氧氣及能量的消耗，亦不需增加額外的設備投資，卻可大大降低發酵的成本。綜上所述，vgb基因的發現和研究為利用分子生物學技術解決微生物發酵問題提供了良好途徑。

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