氯吡脲完全抗原的合成與鑒定

摘要：氯吡脲（Forchlorfenuron）是半抗原，只有將其與載體蛋白偶聯(lián)形成完全抗原才能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。以2-氯異煙酸為基礎(chǔ)設(shè)計并合成了半抗原CPPU-H1和CPPU-H2，并采用活性酯法分別將其與載體蛋白偶聯(lián)制備完全抗原；采用質(zhì)譜和核磁共振對半抗原CPPU-H1和CPPU-H2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并用紫外光譜法和ELISA法對完全抗原進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，半抗原CPPU-H1和CPPU-H2成功合成，且合成后的CPPU-H1-BSA和CPPU-H2-OVA具有吸收峰疊加效應(yīng)，表明CPPU完全抗原合成成功，其偶聯(lián)比分別為16.8∶1和22.3∶1；間接ELISA測定4次免疫后小鼠血清效價最高可達(dá)1∶25 600。CPPU完全抗原的制備為抗CPPU抗體的制備及免疫學(xué)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：氯吡脲；半抗原；完全抗原；鑒定

中圖分類號：S482.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-3945-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.036

Abstract： Forchlorfenuron（CPPU） was hapten which must be coupled with the carrier protein to form complete antigen in order to stimulate animals to secrect anti-CPPU antibodies. The hapten CPPU-H1 and CPPU-H2 were designed and synthesized on the basis of 2-Chloro-4-pyridinecarboxylic acid， and the complete antigen were prepared by coupling with CPPU-H1 and CPPU-H2 with carrier proteins using active ester method， respectively. CPPU-H1 and CPPU-H2 were identified by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. CPPU-H1-BSA and CPPU-H2-OVA were identified by ultraviolet spectrum and ELISA. The structure of CPPU-H1 and CPPU-H2 were consistent with the predictive structure by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. CPPU artificial antigen（CPPU-H1-BSA and CPPU-H2-OVA） showed the superposition phenomenon by ultraviolet spectrum， and the coupling ratios of CPPU-H1-BSA and CPPU-H2-OVA were 16.8∶1 and 22.3∶1， respectively. The titer was high up to 1∶25 600 after four times immunization of antibody against CPPU in mice serum by detected with indirect ELISA. The preparation of complete antigen of CPPU contributes to the anti-CPPU antibody production and immunoassay development.

Key words： CPPU； hapten； complete antigen； identification

氯吡脲（Forchlorfenuron），又名調(diào)吡脲、吡效隆、CPPU等，是一種高效低毒的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大細(xì)胞體積[1]、促進(jìn)器官形成和營養(yǎng)物質(zhì)的合成[2，3]、促進(jìn)坐果和果實膨大[4-7]、延緩果實衰老[8]、提高產(chǎn)量[9]等多種作用。因此，被用于葡萄、黃瓜、西瓜、西紅柿以及獼猴桃等瓜果的生產(chǎn)中[10]。因CUUP可能會對機(jī)體健康帶來潛在危害[11，12]，許多國家都對其最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（MRL）作出了規(guī)定，如美國葡萄中MRL為30 μg/kg、歐盟獼猴桃中MRL為50 μg/kg、中國獼猴桃和葡萄中MRL為50 μg/kg。目前有關(guān)CPPU的檢測方法主要是儀器檢測法，如近紅外高光譜成像法[13]、液相色譜法[14]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[15，16]等。儀器檢測法存在樣品前處理復(fù)雜、操作時間長且成本高，需專業(yè)儀器及專業(yè)操作人員，不適用于大批量樣品的現(xiàn)場檢測。而免疫學(xué)檢測法具有快速、簡便、靈敏以及成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批量樣品的現(xiàn)場檢測。免疫學(xué)檢測法的基礎(chǔ)是獲得抗CPPU的抗體，其前提是制備具有免疫原性CPPU完全抗原。目前CPPU完全抗原制備方法較少[17]且國內(nèi)未見報道。因此，本研究通過2-氯異煙酸與SOCl2反應(yīng)制備出酰氯后再與疊氮鈉反應(yīng)得到疊氮化合物，然后再與對氨基苯乙酸或?qū)Π被郊姿岱磻?yīng)合成出帶有羧基的CPPU半抗原，最后通過活潑酯法將其與載體蛋白偶聯(lián)制備出CPPU完全抗原。在此過程中，采用紫外光譜法、HPLC-MS法以及核磁共振等手段對半抗原、完全抗原進(jìn)行分析鑒定。本研究重點(diǎn)在于CPPU人工半抗原以及完全抗原制備與鑒定，為后續(xù)免疫學(xué)檢測方法的研究提供基礎(chǔ)和試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試劑

對氨基苯甲酸、疊氮鈉購于上海生工生物工程有限公司；對氨基苯乙酸、2-氯異煙酸購于上海安耐吉化學(xué)；氯化亞砜、甲苯購于阿拉丁試劑有限公司；牛血清蛋白（BSA）（98%）、卵清蛋白（OVA）（98%）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（99%）、N，N′-二環(huán)己基碳酰亞胺（DCC）（99%）購于Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計（日本島津公司），WD-2102A型酶標(biāo)儀（北京市六一儀器廠），液質(zhì)聯(lián)用儀（美國AB公司）。

1.3 方法

1.3.1 半抗原合成 參考文獻(xiàn)[21]的方法并稍作修改：稱取5.0 g 2-氯異煙酸，加入10 mL SOCl2，回流攪拌反應(yīng)2 h后蒸干SOCl2；再加入20 mL無水甲苯減壓蒸餾得到淺黃色的油狀物（即酰氯）；再稱取2 g疊氮鈉用15 mL蒸餾水溶解，將上述制備的酰氯用20 mL丙酮溶解稀釋緩慢地滴加到疊氮鈉溶液中，室溫下反應(yīng)40 min后加入20 mL蒸餾水并用正己烷萃取，將萃取液正己烷相用無水硫酸鈉干燥，最后減壓蒸餾得到純凈的疊氮化合物。稱取0.7 g對氨基苯乙酸或?qū)Π被郊姿?，?0 mL甲苯溶解，將溶有0.9 g疊氮化合物的甲苯溶液緩慢滴加，回流1.5 h，此時溶液中有大量沉淀生產(chǎn)；過濾除去甲苯溶液，用1 mol/L NaOH溶液溶解不溶物，之后用乙酸乙酯萃取除去雜質(zhì)，最后用1 mol/L鹽酸將溶液pH值調(diào)至酸性，此時溶液中有大量白色沉淀析出，收集沉淀并用水多次洗滌后進(jìn)行干燥即得到半抗原CPPU-H1或CPPU-H2。

1.3.2 完全抗原的制備

1.3.2.1 包被抗原的制備

采用活性酯法將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備包被抗原，具體步驟為：稱取CPPU-H1半抗原0.1 mmol溶于0.5 mL DMF中，攪拌條件下加入0.2 mmol DCC和0.2 mmol NHS，4 ℃下攪拌反應(yīng)過夜，離心后取上清液為A液；稱取適量BSA（半抗原與BSA的摩爾比為60∶1）溶于適量的PBS（10 mmol/L，pH 7.4）中，攪拌溶解制備B液。在攪拌條件下，將A液逐漸滴入B液中，4 ℃下反應(yīng)12 h。離心后，取上清液，4 ℃下用PBS透析3 d，每天更換3次透析液。將得到的完全抗原CPPU-H1-BSA測定濃度后分裝于離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 免疫抗原的制備 以O(shè)VA為載體蛋白，在半抗原CPPU-H2的基礎(chǔ)上制備免疫抗原CPPU-H2-OVA，具體方法同包被抗原。

1.3.3 半抗原和完全抗原的鑒定

1.3.3.1 半抗原的鑒定

采用質(zhì)譜法（LC-MS）與核磁共振法（13C-NMR、1H-NMR）鑒定CPPU-H1和CPPU-H2。

1.3.3.2 完全抗原的鑒定

采用紫外分光光度計對CPPU-H1、CPPU-H2、BSA、OVA、CPPU-H1-BSA和CPPU-H2-OVA進(jìn)行掃描，記錄200～400 nm波長的最大吸收峰及特征值。根據(jù)記錄的特征波長判斷是否成功制備完全抗原CPPU-H1-BSA和CPPU-H2-OVA。根據(jù)完全抗原偶聯(lián)比的計算公式[18]，計算免疫抗原以及包被抗原的偶聯(lián)比。

1.3.4 完全抗原免疫原性的鑒定

1.3.4.1 抗血清的制備 將制備的免疫抗原免疫3只6～8周齡雌性Balb/c小鼠。免疫抗原用生理鹽水稀釋成1 mg/mL，首次免疫時免疫抗原與弗氏完全佐劑乳化完全后，于皮下和腹腔多點(diǎn)免疫，免疫劑量為100 μg/只。2周后進(jìn)行第2次免疫，免疫抗原與弗氏不完全佐劑乳化完全后于皮下、腹腔等位置進(jìn)行多點(diǎn)免疫，免疫劑量與首次相同。以后每隔2周免疫1次，方法同第2次，共免疫4次。第4次免疫后從小鼠尾部取血，將血液于4 ℃條件靜置2 h，5 000 r/min離心10 min，取上清即得小鼠抗血清，加入等量甘油，混勻，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.2 抗血清效價的測定 采用間接ELISA方法測定，分別以不同濃度的包被抗原包被酶標(biāo)板，將小鼠抗血清進(jìn)行倍比稀釋后進(jìn)行試驗，并規(guī)定OD450 nm為1.0左右時的抗血清的稀釋倍數(shù)即為抗血清效價，具體如下：①包被。將包被抗原用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋成一系列濃度，然后用每種濃度的包被抗原分別包被2行，100 μL/孔，置于4 ℃包被過夜。②洗滌。傾去孔內(nèi)液體，每孔加PBST洗滌液300 μL，靜置3 min后甩干，共洗滌3次。③封閉。每孔加入120 μL封閉液，37 ℃封閉2 h，傾去孔內(nèi)液體，洗滌方法同“②”。④加樣。除最前面一列孔加入陰性血清作為對照組外，其余各列孔加入從第1孔開始的倍比稀釋的待檢血清，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)60 min，洗滌方法同“②”。⑤加酶標(biāo)二抗。每孔加入100 μL HRP-羊抗鼠IgG（10000稀釋），37 ℃反應(yīng)60 min，洗滌方法同“②”，本步驟共洗滌5次。⑥顯色。每孔加入顯色液100 μL，置于37 ℃避光顯色15 min，然后每孔加入50 μL的10%硫酸以終止反應(yīng)。⑦測定。用酶標(biāo)儀測定各孔OD450 nm值。⑧判定結(jié)果。將OD450 nm為1.0左右的血清最高稀釋倍數(shù)作為抗血清的ELISA效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的鑒定

2.1.1 質(zhì)譜法（ESI-MS）鑒定 將合成的半抗原CPPU-H1、CPPU-H2經(jīng)LC-MS測定，結(jié)果如圖3、圖4所示。經(jīng)計算，半抗原CPPU-H1的相對分子質(zhì)量為305.3，半抗原CPPU-H2的相對分子質(zhì)量為291.5。從質(zhì)譜分析結(jié)果可知，CPPU-H1的m/z為306.2[M+H]+，與CPPU-H1分子量相符；CPPU-H2的m/z為290.0[M+H]-，與CPPU-H2分子量相符。由此可知，半抗原CPPU-H1和CPPU-H2制備成功。

2.1.2 核磁共振法（13C-NMR、1H-NMR）鑒定

2.1.2.1 半抗原CPPU-H1核磁共振鑒定

由圖5可知，合成的半抗原結(jié)構(gòu)中C數(shù)目與預(yù)期結(jié)構(gòu)一致。由圖6可知，化學(xué)位移值為9.33×10-6的氫屬于羥基基團(tuán)的氫。因此，可以判定成功合成帶有羧基基團(tuán)的CPPU-H1半抗原。

由圖7可知，合成的半抗原結(jié)構(gòu)中C數(shù)目與預(yù)期結(jié)構(gòu)一致。由圖8可知，化學(xué)位移值為9.48×10-6的氫屬于羥基基團(tuán)的氫。因此，可以判定成功合成帶有羧基基團(tuán)的CPPU-H2半抗原。

2.2 完全抗原的鑒定

人工半抗原與載體蛋白分子偶聯(lián)會影響載體蛋白的結(jié)構(gòu)，從而可能會增強(qiáng)載體蛋白的紫外吸收，同時也可能因為破壞載體蛋白偶聯(lián)位點(diǎn)周圍的分子結(jié)構(gòu)而削弱其部分紫外吸收，因此通過載體蛋白偶聯(lián)前后紫外光譜圖變化來判斷半抗原與載體蛋白是否偶聯(lián)成功。由圖9、圖10可知，載體蛋白偶聯(lián)上CPPU-H1和CPPU-H2后，其紫外光譜特征吸收峰發(fā)生了變化，由此可以推斷免疫抗原和包被抗原合成成功，經(jīng)計算CPPU-H1-BSA和CPPU-H2-OVA的偶聯(lián)比分別為16.8∶1、22.3∶1。

2.3 抗血清效價的測定

由圖11可知，本研究所制備免疫抗原CPPU-H1-BSA免疫小鼠后可以產(chǎn)生針對CPPU的抗體，其中3號小鼠抗血清效價最高，可以達(dá)到1∶25 600，1號和2號小鼠抗血清效價可以達(dá)到1∶12 800，說明本研究所制備的完全抗原具有良好的免疫原性。

3 結(jié)論

目前，免疫學(xué)檢測方法作為一種快速檢測方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測中，其關(guān)鍵是制備出完全抗原。在人工抗原制備過程中，半抗原必須具有與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團(tuán)（如羧基、氨基以及羥基等）[19]才能與其進(jìn)行偶聯(lián)。本研究首先制備出人工半抗原CPPU-H1和CPPU-H2，然后通過活性酯法分別制備免疫抗原CPPU-H1-BSA與包被抗原CPPU-H2-OVA。在此過程中采用質(zhì)譜法和核磁共振法分別對人工半抗原進(jìn)行檢測，并通過紫外光譜法和間接ELISA法檢測抗血清效價以對完全抗原的結(jié)構(gòu)以及免疫原性進(jìn)行測定。結(jié)果表明，本方法可以成功制備出含羧基基團(tuán)的CPPU人工半抗原以及具有免疫原性的完全抗原。本研究旨在為制備抗CPPU單克隆抗體以及后續(xù)免疫學(xué)分析方法的建立奠定理論基礎(chǔ)。

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