微波輔助酶法提取白花蛇舌草多糖的工藝優化

摘要：為優化微波輔助酶法提取白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）多糖工藝。在單因素試驗基礎上，應用中心組合設計，采用二次多項式逐步回歸分析對提取工藝條件進行優化，確定微波輔助酶法提取白花蛇舌草多糖工藝最佳條件為酶解時間2.9 h，酶解溫度60 ℃，酶用量0.9%，pH 6.0；按此工藝條件，提取3次，白花蛇舌草多糖平均含量可達31.02%。

關鍵詞：白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）；多糖；微波輔助；酶法

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-3975-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.044

Abstract： Microwave-assisted enzymetic extraction of polysaccharide in Hedyotis diffusa Willd. was studied by using single factor experiment and central composite design combining quadratic polynomial stepwise regression analysis. It was concluded that the optimal conditions of extraction were enzymolysis time 2.9 h，enzymolysis temperature 60 ℃，enzyme dosage 0.9% and pH 6.0. Under these conditions， the three-time extraction yield of polysaccharide in Hedyotis diffusa Willd. was up to 31.02%.

Key words： Hedyotis diffusa Willd.； polysaccharide； microwave-assisted； enzymetic method

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.） 的干燥全草，廣泛分布于中國東南和西南各省，具有清熱解毒、消痛散結、利濕除濕的功效，專治各種類型炎癥，是民間常用中草藥[1]。白花蛇舌草中含量大量生物活性物質，如總黃酮、總多糖、齊墩果酸、豆甾醇、三萜類等成分，其中多糖類物質具有抑制腫瘤、抗菌消炎和免疫調節的作用[2]。臨床上廣泛應用于各種癌癥的治療，如肝癌、食道癌、結腸癌、鼻咽癌等，并取得了較好的療效[3]。目前，關于白花蛇舌草多糖的提取方法主要有熱水回流法[4-6]、醇提法[7]及脫脂水提醇沉法[8]，且優化白花蛇舌草多糖的提取工藝多采用正交試驗法，而用微波輔助聯合酶法提取白花蛇舌草多糖的方法鮮見報道。本研究在單因素試驗基礎上，使用響應面分析法優化白花蛇舌草多糖的提取工藝，為白花蛇舌草多糖的進一步開發研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白花蛇舌草藥材購自贛州市丁氏草藥店，經贛南醫學院藥學院中藥鑒定教研室程齊來教授鑒定。

葡萄糖標準品（含量≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；纖維素酶（3×104 U/g，江蘇淮安百麥綠色生物能源有限公司）；無水乙醇、乙酸乙酯、鹽酸、苯酚、濃硫酸均為分析純。

UV-6100PCS型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（金壇市白塔新寶儀器廠）；HH-2型數顯恒溫水浴鍋（金壇市城東新瑞儀器廠）；WF-4000型微波快速反應系統（上海屹堯分析儀器有限公司）；FW135型手提中藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；FA1104型分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；202A-2型電熱干燥箱（上海陽光試驗儀器有限公司）；KQ3200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-50B型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取50 mg D-無水葡萄糖標準品，用蒸餾水溶解，定容于50 mL容量瓶中，配成質量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準溶液備用。吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，再分別取0.2 mL溶液于8個干燥比色管中，向各管分別加入0.5 mL 5%苯酚、2.5 mL濃硫酸，搖勻，室溫下放置20 min，以不加標準溶液為空白，在波長490 nm處分別測定其吸光度，繪制葡萄糖質量濃度與吸光度的標準曲線，所得回歸方程為Y=0.082 8X+0.031 0，R2=0.999 7，式中Y為提取液的吸光度，X為提取液中多糖的質量濃度。

1.2.2 白花蛇舌草多糖的提取

1）白花蛇舌草脫脂粉的制備：將烘干的白花蛇舌草粉碎后，過60目篩，用一定比例的乙酸乙酯超聲提取30 min，棄去乙酸乙酯，濾渣揮干乙酸乙酯，干燥后冷卻備用，并稱重。

2）酶處理：準確稱取白花蛇舌草脫脂粉1.0 g加25 mL去離子水，置于250 mL具塞錐形瓶中，用鹽酸溶液調pH，加入一定量纖維素酶在一定溫度下恒溫反應一定時間后，滅酶20 min。

3）微波萃?。簩⒚附夂玫幕旌弦豪鋮s至室溫后移入微波快速反應系統中，微波反應一定時間后，趁熱過濾，將濾液80～90 ℃真空減壓濃縮，得濃縮液。

4）醇沉：將濃縮液按體積比1∶3加入95%乙醇，搖勻后進行醇沉，靜置過夜。

5）干燥：將醇沉液4 000 r/min離心10 min，沉淀物置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥，干燥后的產物即為白花蛇舌草粗多糖。

1.2.3 多糖含量測定 取白花蛇舌草多糖提取物適量，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加蒸餾水使其溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密量取4 mL置于10 mL量瓶中加蒸餾水至刻度，搖勻，得到白花蛇舌草多糖供試品溶液；精密量取0.2 mL置具塞試管中，按“1.2.1”操作。測定吸光度，計算多糖提取粗品中多糖的含量。

多糖含量=樣品溶液中葡萄糖含量×樣品溶液稀釋倍數×反應液體積/粗提物重量×100%

1.2.4 單因素試驗 ①酶解時間?？疾觳煌附鈺r間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對白花蛇舌草多糖含量的影響；②酶解溫度?？疾觳煌附鉁囟龋?0、45、50、55、60 ℃）對白花蛇舌草多糖含量的影響；③酶用量。分析不同比例酶用量（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%）對白花蛇舌草多糖含量的影響；④pH。分析不同pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對白花蛇舌草多糖含量的影響；⑤微波萃取時間?？疾觳煌⒉ㄝ腿r間（2、4、6、8、10、12 min）對白花蛇舌草多糖含量的影響。

1.2.5 響應面試驗設計 根據單因素試驗結果，微波萃取時間對多糖含量影響不大，固定微波萃取時間為4 min，酶解時間（A）、酶解溫度（B）、加酶量（C）及pH（D）對多糖含量影響較大，以這4個因素為自變量，對提取工藝條件進行響應面分析，試驗因素和水平見表1。

1.2.6 驗證試驗 對Box-Behnken中心組合試驗優化后的白花蛇舌草多糖提取工藝進行驗證試驗，重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶解時間對白花蛇舌草多糖含量的影響 由圖1可知，隨著酶解時間的增加，白花蛇舌草多糖含量不斷增加，當酶解時間達到2.5 h后，多糖含量不再增加，反而下降。這是因為酶解時間太短，酶解不充分；酶解時間太長，又會造成多糖分解或結構變化。因此，最佳酶解時間為2.5 h。

2.1.2 酶解溫度對白花蛇舌草多糖含量的影響 由圖2可知，隨著酶解溫度的增加，白花蛇舌草多糖含量先逐漸增加，在酶解溫度為55 ℃時，多糖含量達到最大值。這是因為隨著酶解溫度的升高，酶解活性會增強，但超過最適溫度后，酶催化能力反而下降，故酶解溫度超過55 ℃后，多糖含量呈下降趨勢。因此，選擇白花蛇舌草多糖提取的適宜酶解溫度為55 ℃。

2.1.3 酶用量對白花蛇舌草多糖含量的影響 由圖3可知，當酶用量從0.3%增至0.6%時，白花蛇舌草多糖含量增幅最大；酶用量從0.6%增至0.9%時，多糖含量基本不變。隨后增加酶用量，多糖的含量逐漸下降。這是因為酶用量飽和后，對多糖組分有包埋效應，反而限制多糖組分從細胞組織中析出。因此，確定酶用量為0.6%。

2.1.4 pH對白花蛇舌草多糖含量的影響 由圖4可知，隨著pH的增加，白花蛇舌草多糖含量在pH 5.5以前一直處于上升趨勢。pH超過5.5后，多糖含量開始下降。這可能是由于pH過高或過低都會影響酶的活性，進而影響多糖得率，因此，選擇酶解體系pH以5.5為宜。

2.1.5 微波萃取時間對白花蛇舌草多糖含量的影響 由圖5可知，隨著微波處理時間延長，白花蛇舌草多糖含量先增加后下降。當微波萃取時間為 4 min時，多糖含量達到最大值。隨后繼續增加微波處理時間，多糖含量呈下降趨勢。因為微波萃取時間過長，會導致多糖分解，致使含量下降。因此，初步確定微波萃取最佳時間為4 min。

2.2 白花蛇舌草多糖提取工藝回歸模型的建立及方差分析

應用 Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合，對試驗結果進行響應面分析，得到方差分析結果（表3）和響應曲面（圖6、圖7、圖8）。通過多元回歸擬合分析得到百花蛇舌草多糖含量（Y）與酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶用量（C）和pH（D）之間的二次多項回歸方程：Y=301.42-0.80×A+1.83×B-8.93×C-121.58×D-0.04×A×B+15.98×A×C+3.64×A×D+0.13×B×C+1.54×B×D-3.93×C×D-5.82×A2-0.09×B2-10.83×C2+2.95×D2。

由表3可以看出，回歸方程的P<0.01，表明該回歸模型達到極顯著水平。模型的確定系數達0.958 8，說明該模型能解釋95.88%響應值的變化。失擬項不顯著（P=0.887 2>0.05），表明方程對試驗擬合良好，試驗誤差小。各因素對多糖含量的影響極顯著（P<0.01），影響程度大小依次為酶解溫度>pH>酶解時間>酶用量?？疾煲蛩亻g的交互作用，由方差分析可知，在數學回歸模型中，AC和BD二項存在極顯著的交互作用，即酶解時間與酶用量、酶解溫度和pH的交互作用對多糖含量有極顯著影響（P<0.01）；酶解時間和pH的交互作用對多糖含量影響顯著（P<0.05）。根據Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行最優化分析，確定最佳工藝參數為酶解時間2.9 h，酶解溫度60 ℃，酶用量0.9%，pH 6.0，在此條件下預測多糖含量為31.97%。

2.3 驗證試驗

為了檢驗預測結果的可靠性，采用上述最優提取條件，即酶解時間2.9 h，酶解溫度60 ℃，酶用量0.9%，pH 6.0，進行3次驗證試驗，得到白花蛇舌草多糖含量平均值為31.02%，理論含量31.79%，與理論值相差不大。

3 小結與討論

微波輔助萃取又稱微波萃取，是利用微波能來提高萃取速率的一種最新技術。與傳統的回流萃取、索氏萃取和超聲波萃取等方法相比，具有設備簡單、適用范圍廣、效率高、省時間、省試劑、污染小等特點[9]。纖維素酶能水解細胞壁上的纖維素，使細胞內多糖類物質充分溶出，從而提高多糖得率。因此，采用纖維素酶解與微波萃取相結合的方法可以獲得理想的效果。

本試驗用微波輔助酶法提取白花蛇舌草中多糖，得出最佳工藝參數為酶解時間2.9 h，酶解溫度60 ℃，酶用量0.9%，pH 6.0，該試驗條件下多糖含量為31.02%（n=3）。本試驗得到的白花蛇舌草中多糖含量較高，有一定的研究意義，可為白花蛇舌草的提取、純化及深入開發利用等提供一定的理論基礎和科學依據。

參考文獻：

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