鴨FMO3基因魚腥味敏感位點的檢測

摘要：畜禽產品的魚腥味問題嚴重影響肉蛋奶產品的風味和人們對畜禽產品的接受能力，FMO3基因的突變會引發魚腥味綜合征。通過DNA池和測序技術檢測導致雞蛋、鵪鶉蛋產生魚腥味的FMO3基因敏感位點在鴨中是否存在，尋找鴨蛋魚腥味產生的原因。結果表明，在鴨FMO3基因第7外顯子，共檢測到6個SNPs，均為同義突變，在FATGY高度保守區未檢測到堿基突變，即導致雞蛋和鵪鶉蛋產生魚腥味的FMO3基因敏感位點在鴨中并沒有檢測到。

關鍵詞：鴨；FMO3基因；突變；魚腥味

中圖分類號：Q78；S834 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-4018-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.055

Abstract： Fish-odour in meat，cow milk and eggs seriously affect the flavor and reception ability of domestic animal products.The fish-odour syndrome is due to the loss-of function mutation in FMO3 gene. DNA pooling and sequencing were used to screen the mutation site of FMO3 gene，which leaded to the fishy off-flavor in chicken and quail eggs，thus exploring the cause of fish-odour in duck eggs. The results showed that 6 synonymous mutations were detected in exon 7，and no SNPs in highly conserved region（FATGY motif） of duck FMO3 gene. It indicated that the mutation site leading to the fishy off-flavor in chicken and quail eggs was not observed in duck.

Key words： duck； FMO3 gene； mutation； fish-odour

人與動物肝臟中的含黃素單氧化酶（Flavin-containing monooxygenase 3，FMO3）可促進食物中的三甲胺（Trimethylamine，TMA）氧化成無氣味的N-氧化三甲胺（Trimethylamine N-oxide，TMAO）隨體液排出體外[1]。FMO3基因的突變可導致三甲胺氧化能力下降，隨體液排出的三甲胺產生濃重的魚腥味，即引發魚腥味綜合征[2]。魚腥味綜合征在人類中是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，現已證實人FMO3基因的兩個無義突變（E305X和E314X）會導致黃素單氧化酶完全失活，進而引起人類魚腥味綜合征[3]；牛奶中的魚腥味與FMO3基因R238X無義突變有關[4，5]；在褐殼蛋中魚腥味綜合征較為明顯，這是由雞FMO3基因FATGY高度保守區的一個錯義突變（T329S）引起的[6]；當飼料中含有魚粉、菜子粕或過量的膽堿時，極易誘發帶有這種基因缺陷的蛋雞產生魚腥味雞蛋[7，8]。魚腥味雞蛋中三甲胺含量是正常雞蛋（0.1 μg/g）的10倍以上，三甲胺的沉積會產生非常難聞的氣味，嚴重降低了雞蛋的品質和口感。德國羅曼公司已將T329S突變位點作為遺傳標記應用于魚腥味綜合征性狀的選擇并成功建立了無魚腥味蛋雞群體。隨后，在鵪鶉中也發現FMO3基因FATGY高度保守區存在錯義突變（T329I），可能會產生類似于雞中的遺傳效應；同時，還發現了一個與鵪鶉蛋中TMA含量高度相關的Q319X無義突變，該突變至少降低了FMO3酶40%的活性，引起魚腥味鵪鶉蛋的出現[9]。

畜禽產品的魚腥味問題嚴重影響肉蛋奶產品的風味和人們對畜禽產品的接受能力。本試驗旨在通過分子遺傳手段，檢測導致雞蛋、鵪鶉魚腥味的FMO3基因突變位點在鴨中是否存在，以期從遺傳角度控制鴨蛋中魚腥味的出現，為鴨蛋品質的選育及今后無魚腥味基因蛋鴨群體的建立提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 DNA池構建

櫻桃谷鴨、北京鴨、連城白鴨、白改鴨、野鴨、康貝爾鴨、山麻鴨、紹興鴨、縉云麻鴨及荊江麻鴨的血樣DNA由華中農業大學動物科技學院家禽實驗室提供。同一個品種30個DNA樣品同濃度等體積混合構建品種DNA池。

1.2 引物設計與PCR反應

根據鴨FMO3基因序列信息（NW_004676298、XM_005008854），采用Primer Preimer 5.0軟件設計特異引物：F6L（5′-TGTCGGTCCCAGATGG-3′）、F7R（5′-CCTTACTTGGTCCATGCA-3′），擴增FMO3基因FATGY高度保守區所在的整個外顯子區域（片段大小為458 bp）。利用構建的DNA池進行PCR反應。15 μL反應體系中含10×Buffer（含Mg2+）1.5 μL、dNTP（10 mmol/μL）0.3 μL、上/下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.1 μL及模板DNA 1.0 μL。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統拍照保存。

1.3 測序及分析

將PCR產物委托武漢擎科新業生物技術有限公司進行純化測序，利用DNA STAR軟件對測序結果進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 鴨FMO3基因擴增結果

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，獲得了458 bp的片段（圖1），與預期結果一致，條帶清晰且單一，可直接進行回收測序。

2.2 測序分析

測序結果顯示，共檢測到6個SNPs（圖2），均為堿基轉換，其中4個SNPs分別引起了MspⅠ、BccⅠ、TaiⅠ和AvaⅡ酶切位點的改變（表1）。這6個SNPs均為同義突變，未引起氨基酸的改變。在FMO3基因FATGY高度保守區未檢測到突變。

3 討論

雞蛋的魚腥味問題一直困擾著蛋雞生產者和研究者。根據對人和牛研究結果，FMO3基因突變能夠引起魚腥味綜合征，研究者通過對雞FMO3基因進行測序，共檢測出17個多態位點；通過多態位點和魚腥味綜合征的連鎖分析發現，只有位于編碼區第984個堿基位置的突變與蛋雞魚腥味綜合征顯著相關[6]。該突變導致FMO3蛋白的第329個氨基酸由蘇氨酸（T）變成絲氨酸（S），因此定義該突變位點為T329S。研究表明，該位點對于FMO3基因發揮正常功能是必不可少的[10]。因遺傳背景及選育程度等因素影響，T329S突變位點在各雞種中的分布不同。該位點已被德國羅曼公司作為遺傳標記應用于對魚腥味綜合征性狀的選擇，即通過基因檢測將該突變基因從育種群體中剔除。在鵪鶉FMO3基因第7外顯子FATGY高度保守區檢測到可能影響FMO3酶活性的T329I錯義突變[9]。本研究在鴨FMO3第7外顯子上共檢測到6個SNPs，均為同義突變，并未引起氨基酸的改變，其中5個與WANG等[11]的檢測結果一致。在特別關注的FATGY高度保守區未檢測到堿基突變，即導致禽類的雞蛋和鵪鶉產生魚腥味的FMO3基因敏感位點在鴨中并沒有檢測到，鴨蛋魚腥味可能與FMO3基因其他區域有關或與其他基因有關，尚待進一步研究。

參考文獻：

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