木薯MeP5CS和MeP5CR基因克隆及其干旱脅迫下的表達分析

摘要：在不同濃度（0、20%、30%、40%、50%）PEG處理下考察木薯（Manihot esculenta Crantz）葉片中脯氨酸含量的動態變化。從木薯中分別克隆了MeP5CS和MeP5CR基因，對其序列進行生物信息學分析，并分析了MeP5CS和MeP5CR基因在20% PEG脅迫處理下各組織中的表達。結果表明，脯氨酸含量受滲透脅迫快速誘導，在一定范圍內隨PEG濃度升高而明顯升高，表現出較好的相關性。序列分析表明，MeP5CS基因cDNA全長2 217 bp，編碼738個氨基酸，含有P5CS保守結構域；MeP5CR基因cDNA全長828 bp，編碼275個氨基酸，含有P5CR保守結構域，它們分別與麻風樹和蓖麻中的P5CS、P5CR親緣關系較近。MeP5CS和MeP5CR基因在轉錄水平受到滲透脅迫的調控。

關鍵詞：木薯（Manihot esculenta Crantz）；MeP5CS；MeP5CR；基因克隆；干旱；表達分析

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）15-4024-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.15.057

Abstract： Dynamic changes of proline content were investigated in cassava（Manihot esculenta Crantz） leaves in response to different concentration of PEG（polyethylene glycol） treatments（0，20%，30%，40% and 50%）. MeP5CS and MeP5CR were cloned in cassava and their sequences were analysed by bioinformatics method. The expression of MeP5CS and MeP5CR genes in different organs was analysed under 20% PEG treatment. The results showed that proline content were rapidly induced by osmotic stress，and at a certain extent，the increase of proline content was linearly correlated with PEG concentrations. Sequence analysis revealed that full length cDNA sequence of MeP5CS was 2 217 bp，which encoded 738 amino acids and contained P5CS conserved domain. The full length cDNA sequence of MeP5CR was 828 bp，which encoded 275 amino acids and contained P5CR conserved domain. They both had close genetic relationship with P5CS and P5CR，respectively，in Jatropha curcas and Ricinus communis. qRT-PCR results showed that the expression of both MeP5CS and MeP5CR were regulated by osmotic stress. Key words： cassava（Manihot esculenta Crantz）； MeP5CS； MeP5CR； gene clone； drought； expression analysis

在干旱、鹽漬等脅迫條件下，植物體內脯氨酸含量顯著增加[1]。一定程度上，脯氨酸含量反映了植物的抗逆性，具有防止細胞脫水的作用，同時抗旱性強的品種往往能積累較多的脯氨酸[2]。因此，測定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標之一。木薯（Manihot esculenta Crantz）是重要的糧食作物和經濟作物，具有抗旱的特性[3]。然而，長時間或較為嚴重的干旱脅迫嚴重地影響了木薯的生長和發育（如光合作用下降等），導致木薯塊根產量減少[3]。目前，對木薯抗旱分子機制的了解還十分有限。

近年來，探討脯氨酸合成相關酶基因在轉基因植物中的作用機制成了脯氨酸基因工程研究中的熱點。將脯氨酸生物合成關鍵酶基因導入植株，以期獲得轉基因株系提高其對滲透脅迫的抵御或耐受力，進而培育出高抗逆性的新品種。脯氨酸合成途徑可以分為兩種：谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑[4]。大部分研究認為，在受干旱脅迫時，谷氨酸途徑是脯氨酸生物合成的主要途徑，而在該途徑中存在兩個關鍵酶，即吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）和吡咯琳-5-羧酸還原酶（P5CR）[5]，研究者從甘蔗[6]、柑橘[7]和煙草[8]等植物中克隆了這兩個酶基因，并通過轉基因的方法研究其功能，但在木薯中鮮見相關報道。

本研究在不同濃度（0、20%、30%、40%和50%）PEG脅迫處理下考察了木薯葉片中脯氨酸含量的動態變化，從木薯中分別克隆了MeP5CS和MeP5CR基因，對其序列進行初步的生物信息學分析，并分析了木薯MeP5CS和MeP5CR基因在20% PEG脅迫處理下各組織中的表達，旨在闡述干旱脅迫對木薯葉片脯氨酸含量和介入脯氨酸代謝基因表達的影響，為后續轉基因工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及干旱處理

試驗材料木薯為華南124（SC124），具有較強的抗旱性[1]，試驗在溫室大棚中進行。將粗細均勻一致、長約15 cm的木薯種莖扦插于塑料盆（高18.8 cm，上直徑18.5 cm，下直徑14.8 cm）種植，栽培基質選用蛭石和沙子同體積混合，種植10 d后進行間苗，保留1苗/盆。種植60 d后（植株約0.5 m高，6～8片葉），在上午8∶00（記為0 h）用不同濃度（0、20%、30%、40%、50%）的PEG 6 000溶液進行模擬干旱處理，以澆灌自來水為對照，在處理后0、3、6、12、24、48 h分別收集木薯葉片，采用磺基水楊酸法[2]測定脯氨酸含量。每個處理3次重復。

1.2 基因克隆

用RNA Plant Plus Reagent試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取木薯SC124葉片總RNA，用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（Fermentas公司）合成cDNA用于后續試驗。

根據Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov）木薯數據庫和木薯基因組數據庫[9]，獲得2條與脯氨酸合成相關的序列，二者均包含了一個完整的開放閱讀框（ORF）。根據ORF采用生物學軟件Primer Premier 5.0設計引物（表1），進行PCR擴增。反應程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃ 10 min。將擴增得到的片段連接到pMD19-T載體后，轉化DH5α感受態細胞，挑選陽性克隆。經菌落PCR和質粒酶切驗證后送上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 生物信息學分析

將測序得到的核苷酸序列和推導的氨基酸序列采用BLAST軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列搜索；采用CDD數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進行保守結構域預測；采用Clustal X軟件進行序列比對；利用MEGA 6.0軟件內置的Neighbor-Joining法（bootstrap=1 000）構建系統進化樹。

1.4 基因表達分析

為了研究干旱條件下不同組織中基因表達量的變化，用20%PEG處理木薯0、3、24 h后，分別采集了不同葉片（包括未展開葉、第一片完全展開葉和老葉）和根的樣本，分別用RNA Plant Plus Reagent試劑提取總RNA，用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA，進行qRT-PCR分析，引物見表1。

qRT-PCR采用SYBR GreenⅠ試劑盒（TaKaRa公司），按照操作說明和推薦的反應體系在 Mx 3005P型熒光定量PCR儀（Stratagene公司）上進行，反應程序：95 ℃預變性30 s；95℃ 10 s，55℃ 10 s， 72 ℃ 20 s，40個循環。每個樣品3次重復，表達量按照2-ΔΔCt進行計算[11]。

2 結果與分析

2.1 木薯葉片脯氨酸含量在不同干旱脅迫下的動態變化

為了研究木薯干旱脅迫下脯氨酸含量的動態變化，在5個不同的PEG濃度（0%、20%、30%、40%、50%）、6個不同的時間點（0、3、6、12、24和48 h）處理下分別測定了木薯葉片中的脯氨酸含量。如圖1所示，在不同PEG濃度處理下，脯氨酸含量在處理后0～24 h均呈線性增長，24～48 h在20%、30%、40%PEG處理下，脯氨酸含量隨著PEG濃度升高而明顯升高；然而當PEG濃度升至50%時，脯氨酸含量下降，表明木薯在高濃度（如50%）PEG下處理較長時間（如>24 h）可能會破壞其細胞滲透調節的能力。干旱脅迫能誘導木薯葉片中脯氨酸含量的增加；在以后的木薯干旱試驗中，應該選擇適當的PEG濃度（如20%、30%）來模擬較長時間的干旱脅迫。

2.2 MeP5CS和MeP5CR基因克隆與序列分析

以木薯SC124 cDNA為模板，用基因特異性引物進行PCR擴增，克隆目的基因的全長cDNA序列（圖2）。將擴增產物連接pMD19-T載體，經測序、序列比對后，分別命名為MeP5CS和MeP5CR。

MeP5CS基因全長編碼區序列為2 217 bp，編碼738個氨基酸（圖3A）。將其與文庫中獲得的參考序列比對，存在9個堿基差異，其中1個為非同義突變，這可能是由于不同木薯品種之間的差異造成的。保守結構域分析顯示，MeP5CS含有P5CS保守結構域（PLN02418，圖3B），證明克隆的就是MeP5CS基因。BLASTN分析顯示，MeP5CS與麻風樹（XM_012233139）和蓖麻（XM_002524184）P5CS基因的同源性較高，核苷酸序列相似性分別達到89%和88%。用蛋白質序列構建MeP5CS基因的進化樹，分析結果也表明，木薯MeP5CS與麻風樹（Jatropha curcas，XP_012088529）和蓖麻（Ricinus communis，XP_002524230）P5CS的親緣關系較近（圖3C），而與水稻（Oryza sativa，BAA19916）和小麥（Triticum aestivum，AAX35536）的親緣關系較遠。

MeP5CR基因含有一個完整的開放讀碼框，長度為828 bp，編碼275個氨基酸（圖4A）。將其與數據庫中獲得的木薯參考序列比對發現，兩者之間存在9個堿基差異，但無氨基酸差異。BLASTN分析表明，MeP5CR與蓖麻P5CR基因（XM_002531450）的同源性最高，核苷酸相似性為84%。保守結構域分析顯示，MeP5CR含有P5CR保守結構域（PLN02688，圖4B），證明克隆的就是MeP5CR基因。用蛋白質序列構建MeP5CR基因的進化樹，分析結果表明，MeP5CR與蓖麻（Ricinus communis，XP_002531496）、麻風樹（Jatropha curcas，NP_001303280）P5CR基因的親緣關系較近，而與玉米（Zea mays，NP_001105787）、黑麥草（Lolium perenne，AGS78291）和小麥（Triticum aestivum，AAW82908）的親緣關系較遠（圖4C）。

2.3 MeP5CS和MeP5CR基因表達分析

為了研究MeP5CS和MeP5CR對干旱脅迫的響應，用20%PEG處理木薯0、3和24 h后，分別考察了MeP5CS和MeP5CR在木薯不同葉片（包括未展開葉、第一片完全展開葉和老葉）和根中表達量的變化情況（圖5）。

PEG處理3 h后，MeP5CS在第一片完全展開葉中的表達量稍有下降，在老葉中有輕微上升，然而在PEG處理24 h后，其表達量均明顯上升。相比之下，MeP5CS在未展開葉和根中的表達量變化不大，表明MeP5CS主要在第一片完全展開葉和老葉中起作用。

在未展開葉中，MeP5CR的表達量在3、24 h都明顯下降；在第一片完全展開葉中，MeP5CR的表達量在3 h明顯下降，然后在24 h時升高；在老葉中，MeP5CR的表達量呈現相反的表達趨勢，在3 h先上升然后在24 h下降；在根中，MeP5CR的表達量在3、24 h均輕微下降。上述結果表明，MeP5CS和MeP5CR在轉錄水平受到滲透脅迫的調控。

3 小結與討論

在干旱等逆境因素脅迫下，許多植物通常會大量積累脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等滲透物質。脯氨酸不僅是植物體內的氮源、碳源，作為滲透調節物質，它還在植物抵御滲透脅迫中起著重要作用[12]。有研究表明，脯氨酸累積與植物對干旱和鹽脅迫適應性之間呈正相關[8，13]。本研究中，在PEG處理前期（0～24 h）木薯葉片中脯氨酸含量隨著處理時間的延長呈線性增長，而在處理后期（24～48 h）其含量隨著PEG濃度（20%～40%）升高而明顯升高，表現出較好的相關性，這與前人的研究結果[8，13]一致。

植物體內，脯氨酸的合成是通過谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑進行的。有研究認為滲透脅迫下，兩種途徑在脯氨酸積累中都發揮重要作用[14，15]；也有研究認為在滲透脅迫與氮缺乏時谷氨酸途徑是植物體內脯氨酸合成的主要途徑，而在非脅迫與高氮水平條件下鳥氨酸途徑占優勢[16]。P5CS和P5CR是脯氨酸合成谷氨酸途徑中的兩個關鍵基因，這兩個基因的克隆、分離和遺傳轉化的研究已取得很大進展[17-20]。本研究從木薯葉片中分別克隆了MeP5CS和MeP5CR基因。表達分析表明，MeP5CS在第一片完全展開葉和老葉中的表達量受到滲透脅迫誘導，其表達量變化趨勢與脯氨酸含量上升趨勢較為一致，表明MeP5CS與脯氨酸的合成有關。相比之下，MeP5CR在各葉片中的表達量不但沒有上升，反而下降了，與脯氨酸含量的變化趨勢相反，表明MeP5CR的表達量受到脯氨酸含量的反饋抑制。盡管這一現象在其他物種中也有報道[21]，但其相關機制還有待進一步探討。

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