中成藥木香順氣丸微生物限度檢查方法的驗證研究

摘要：目的 建立中成藥木香順氣丸微生物限度的檢查方法，并對方法進行驗證。方法 按照中國藥典2010年版一部微生物限度的檢查方法，采用常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法（0.5 ml/皿和0.2 ml/皿）進行試驗。結果 根據回收率試驗得出，細菌采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml/皿）進行測定，霉菌和酵母菌采用常規(guī)法進行測定，控制菌采用常規(guī)法進行檢查。結論 此方法可用于中成藥木香順氣丸的微生物限度檢查。

關鍵詞：中成藥；木香順氣丸；微生物限度；驗證

Abstract：Objective To provide a method of the microbial limit test for proprietary chinese medicine Muxiangshunqi Pill and carry out the verification of the method test of method.Methods Routine method，medium dilution method（0.5ml/dish and 0.2ml/dish）were adopted for the test according to test methods of Chinese Pharmacopoeia 2010 edition of a microbial limit.Results Based on recovery test，the number of bacteria were tested by medium dilution method（0.2ml/dish），molds and yeasts were tested by routine method，and using the toutine method for the inspection of the control bacteria.Conclusion The method can be used for microbial limit for proprietary chinese medicine Muxiangshunqi Pill.

Key words：Proprietary chinese medicine；Muxiangshunqi Pill；Microbial limit；Validation

木香順氣丸是由木香、砂仁、香附、檳榔、甘草、陳皮、厚樸、枳殼、蒼術、青皮等中藥組成的復方制劑，主治行氣化濕，健脾和胃，用于濕濁中阻、脾胃不和所致的胸膈痞悶、脘腹脹痛、嘔吐惡心、噯氣納呆。按照《中國藥典》2010年版規(guī)定，在進行藥品中微生物限度檢查時，只有在該檢驗條件下的樣品濃度不足以抑制污染微生物的生長時，才能使供試品中的微生物的得到真實反映，從而保證檢驗結果的科學性和準確 性[1]。對于具有抑菌作用的品種，必須采取一定的措施，如培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法或其中2種方法連用，消除其抑菌作用后，再進行檢驗，以保證方法的可靠性[2]。在進行木香順氣丸微生物限度檢查時發(fā)現(xiàn)其具有一定的抑菌作用，故建立了木香順氣丸微生物限度檢查方法，為該類品種制定微生物限度標準提供了科學依據。

1儀器與材料

1.1儀器MJ-Ⅱ 型霉菌培養(yǎng)箱（生產企業(yè)：上海一恒科技有限公司），SPX-150型生化培養(yǎng)箱（生產企業(yè)：上海金慧科電子有限公司），SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（生產企業(yè)：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2樣品 木香順氣丸（陜西利君現(xiàn)代中藥有限公司，規(guī)格：8袋/盒）。

1.3稀釋液 0.9%無菌氯化鈉溶液（用于菌液稀釋）；pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（用于供試品制備）（按中國藥典方法制備，高壓蒸汽滅菌法滅菌）

1.4培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號140807）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號140904）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號140912）、MUG培養(yǎng)基（批號150413）、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（批號150310）、改良馬丁液體培養(yǎng)基（批號140905）、氯化鈉蛋白胨緩沖液（批號141213）均由北京陸橋技術有限公司生產。

1.5陽性對照菌 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]均由陜西省食品藥品檢驗所提供。

2方法

2.1菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48 h，以上培養(yǎng)物均用0.9%無菌氯化鈉溶液制成50～100 cfu/ml的菌懸液；接種黑曲霉菌至改良馬丁瓊脂斜面25℃培養(yǎng)5 d（用0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫孢子，標準管比濁），再將培養(yǎng)物用0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成50～100 cfu/ml的菌懸液。

2.2供試品溶液制備稱取供試品10 g，研細，加稀釋液100 ml，制備成1∶10供試液。

2.3常規(guī)法

2.3.1試驗組 取1∶10供試液1 ml和試驗菌50～100 cfu，采用常規(guī)法進行細菌、霉菌和酵母菌數(shù)的測定。

2.3.2菌液組 取試驗菌液1 ml，采用常規(guī)法測定所加試驗菌數(shù)。

2.3.3供試品對照組 取1∶10供試液1 ml注入平皿中，不加試驗菌，傾注相應培養(yǎng)基，采用常規(guī)法測定供試品的本底菌數(shù)。

2.3.4回收率的計算 按如下方法計算試驗組的加菌回收率。

首先，用試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)，然后用這個結果再除以菌液組的平均菌落數(shù)，最后再乘以100%，得到回收率結果[4]。

即：試驗組菌回收率（%）=[（試驗組菌數(shù)-供試品對照組菌數(shù)）/菌液組菌數(shù)]×100%

2.3.5結果 試驗結果表明，試驗組金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率均<70%，不可采用常規(guī)法進行細菌數(shù)測定；試驗組白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均>70%，可采用常規(guī)法進行霉菌和酵母菌數(shù)測定，見表1。

2.4培養(yǎng)基稀釋法（0.5 ml/皿）

2.4.1取1∶10的供試液，采用0.5 ml/皿，分別加入試驗菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌50～100 cfu，同常規(guī)法進行試驗。

2.4.2回收率的計算：同常規(guī)法。

2.4.3結果 試驗結果表明，實驗組金黃色葡萄球菌的回收率>70%，可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5 ml/皿）進行測定，驗證方法通過；而試驗組枯草芽孢桿菌的回收率<70%，不可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5 ml/皿）進行測定，見表2。

2.5培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml/皿）

2.5.1取1∶10的供試液，采用0.2 ml/皿，加入試驗菌枯草芽孢桿菌50～100 cfu，同常規(guī)法進行試驗。

2.5.2回收率的計算：同常規(guī)法。

2.5.3結果 試驗結果表明，實驗組枯草芽孢桿菌的回收率>70%，可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml/皿）進行測定，驗證方法通過，見表3。

2.6控制菌檢查方法驗證（常規(guī)法） 當建立產品的微生物限度檢查法時，應進行控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法是否適合于該藥品的控制菌檢查。驗證時，依各品種項下微生物限度標準中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株。驗證大腸埃希菌和大腸菌群時，采用的驗證菌株都是大腸埃希菌。

2.6.1大腸埃希菌 試驗組：取菌數(shù)回收率測定項下1∶10的供試液10 ml和大腸埃希菌試驗菌液10～100 cfu，接種至100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，依據大腸埃希菌檢查法試驗。陰性對照組：取稀釋液10 ml加入到膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 ml中，依據大腸埃希菌檢查法試驗。

2.6.2大腸菌群 試驗組：取菌數(shù)回收率測定項下1∶10的供試液1 ml和大腸埃希菌試驗菌液10～100 cfu，加入到10 ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管中，依據大腸菌群檢查法試驗。陰性對照組：取稀釋液1 ml加入到10 ml乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管中，依據大腸菌群檢查法試驗。

2.6.3結果 試驗結果表明，可采用常規(guī)法進行控制菌（大腸埃希菌和大腸菌群）的檢查，見表4。

2.7結果 本品按照《中國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查法要求，進行方法學驗證試驗，結果可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 ml/皿）進行細菌菌數(shù)檢查，可采用常規(guī)法法進行霉菌和酵母菌數(shù)檢查；可采用常規(guī)法進行大腸埃希菌和大腸菌群的控制菌檢查[5]。

3 討論

由于中成藥含有多種成分，其中任何成分具有抑菌作用，均可能影響微生物限度檢查的準確性，常規(guī)法可用于無抑菌作用或抑菌作用弱的藥物，而對抑菌作用較強的藥物，可采用培養(yǎng)基稀釋法減少藥品中抑菌成分的數(shù)量，從而消除其對細菌、霉菌與酵母菌生長的影響[3]。因此藥品在進行微生物限度檢查前，要排除自身抑菌作用所帶來的干擾，這樣測出的結果才能可靠、有效。中成藥木香順氣丸處方中所含有的木香、蒼術、甘草、厚樸提取物對金黃色葡萄球菌都有明顯的抑制作用[4-7]，蒼術和厚樸提取物還對枯草芽孢桿菌有明顯抑制作用[5，8]。而這幾種中藥材作為木香順氣丸的主要成分，其對微生物限度檢查的影響有多大無法確定，故采用依次漸進的辦法來確定最為合適的檢查方法。從實驗結果表明，木香順氣丸對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑制作用，這與實驗前對成分抑菌作用的分析一致，因此，在進行中成藥微生物限度檢測前，進行必要的成分分析，有一定的參考價值。

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編輯/張燕