利用CRISPR/Cas9建立腸癌抑制基因Mindin的穩定敲除細胞株

摘要：目的 利用CRISPR/Cas9技術建立腸癌抑制基因Mindin的穩定敲除細胞株。方法 針對Mindin基因編碼序列設計三個向導RNA（sgRNA），將表達sgRNA和Cas9蛋白的質粒共同電轉進小鼠成纖維細胞L929中，加入藥物篩選獲得細胞庫。測序檢測細胞庫基因組的突變效率，并從高突變細胞庫中挑取單克隆進一步培養與鑒定。結果 三個sgRNA都能介導CRSIPR/Cas9高效編輯Mindin基因靶位點，從中挑選得到Mindin基因缺失并可穩定遺傳的L929細胞株。結論 我們得到了一個穩定敲除Mindin基因的L929細胞株，為后續研究Mindin基因在腸癌發生與發展過程中的作用提供了必要的研究素材，為其動物模型的建立打下堅實的基礎。

關鍵詞：CRISPR/Cas9；基因敲除；Mindin

中圖分類號：Q7 文獻標識碼：A

CRISPR/Cas9是近年來從古細菌免疫系統中發展起來的一種新型高效的基因組編輯技術，利用人工設計的sgRNA介導外源表達的Cas9核酸酶與基因組靶點特異性結合從而實現對靶序列的特異性切割，進而誘導細胞通過非同源末端連接或同源重組方式來修復斷裂的DNA雙鏈[1-2]。非同源末端連接的修復效率高于同源重組的修復效率，但易形成錯配修復，從而在切割位點引入序列的缺失或插入，引發靶點基因編碼的蛋白發生移碼突變從而實現對靶點基因的敲除。當存在同源片段時，斷裂的DNA鏈可能發生同源重組修復，將外源片段整合到基因組中，從而實現基因的敲除、敲入及突變等[2-3]。

Mindin是一種高度保守的分泌性細胞外基質蛋白[4]，我們研究發現，Mindin是腸癌發病過程中重要的抑癌基因。由于前期對其功能研究的主要手段為RNA干擾技術，是在轉錄后水平降低蛋白的表達，其瞬時性和不徹底性會影響對其功能的深入研究。因此，我們迫切需要利用CRISPR/Cas9技術在基因水平上完全敲除Mindin基因并篩選出可穩定遺傳的細胞株，為進一步深入研究Mindin在腸癌發生與發展過程中的作用提供有力的細胞模型支持。

1 資料與方法

1.1一般資料 L929細胞株（小鼠成纖維細胞株）由廈門大學李勤喜教授實驗室饋贈；pUC57-sgRNA質粒載體（Addgene 51132）以及pST1374-Cas9-NLS表達質粒由上海科技大學黃行許教授饋贈；pBKS質粒由廈門大學林圣彩教授實驗室饋贈。sgRNA寡聚核苷酸鏈引物由廈門安特奧生物有限公司合成；單克隆引物由上海生工生物有限公司合成；質粒測序及單克隆菌液測序由廈門閩博生物有限公司完成。

1.2方法

1.2.1質粒構建 針對Mindin基因編碼序列設計三個sgRNA作用靶點，合成寡聚核苷酸鏈，序列如下：

F1：5’-TAGGactgtgcagggggccggaac-3’ R1：5’-AAACgttccggccccctgcacagt-3’

F2：5’-TAGGcctgccatccctagcggtac-3’ R2：5’-AAACgtaccgctagggatggcagg-3’

F3：5’-TAGGaagtctgcccggtaccgcta-3’ R3：5’-AAACtagcggtaccgggcagactt-3’

寡聚核苷酸序列5’端TAGG和AAAC堿基為pUC57-sgRNA質粒載體通用粘性末端。合成的寡聚核苷酸鏈利用PCR儀退火后連接入經Bsa I酶切的pUC57-sgRNA載體，構建sgRNA表達質粒。所得質粒通過測序檢驗連入片段的正確性。

1.2.2細胞的轉染與篩選 將測序正確的pUC57-sgRNA質粒載體連同pST1374-Cas9-NLS質粒載體利用電轉儀電轉入消化好的L929細胞中，待細胞貼壁生長后換液并加入殺稻瘟菌素（Blasticidin）進行篩選，即可獲得細胞庫。從細胞庫中提取基因組DNA，測序鑒定突變情況。

1.2.3單克隆的挑選與擴增 待對照組細胞全部死亡后，將實驗組細胞利用DMEM培養液進行梯度稀釋，分裝至96孔板中培養，10 d后，于顯微鏡下觀測各孔細胞生長情況，確定真正的單克隆細胞，進行后續培養分析。

1.2.4細胞基因組提取與鑒定 將待鑒定的細胞加入含蛋白酶K的DNA Digestion Buffer（Jackson Lab）中56℃消化過夜，利用酚氯仿抽提法提取細胞基因組DNA。利用單克隆引物TA-F1：5’-tgagtcttgccctgggcaga-3’TA-R1：5’-agctactgtgccctccaaca-3’和TA-F2： 5’-atgcagtcaggcctttgca-3’ TA-R2：5’-acaggtccagactgtcgat-3’進行PCR擴增，所得DNA片段通過連接酶非依賴的克隆構建方法（Ligase independent clone，LIC）將其連入利用BamH I和Xho I酶切好的pBKS質粒載體中，挑選單克隆菌落進行測序分析。

2 結果

2.1 sgRNA的設計和打靶載體的構建 針對Mindin基因組中蛋白編碼序列，我們利用MIT張鋒教授實驗室提供的在線軟件分析了所有的可能sgRNA位點（PAM序列為NGG），從中挑選出三個評分最高的sgRNA位點，設計并合成寡聚核苷酸鏈。合成的寡聚核苷酸鏈利用PCR儀退火后連接入經Bsa I酶切的pUC57-sgRNA載體，構建sgRNA表達質粒。通過測序證實插入片段正確。

2.2 sgRNA效率的檢測 實驗組和對照組轉染完24 h后加入殺稻瘟菌素處理，待對照組細胞全部死亡后，將實驗組剩下的細胞繼續培養至24孔板中。利用酚氯仿抽提法提取細胞基因組進行PCR擴增并測序。三個sgRNA位點的突變情況，見表1，所有測序的克隆均發生不同程度的突變。

2.3 Mindin基因敲除單克隆細胞的獲得 根據細胞庫敲除的情況，我們挑選了sgRNA位點3的細胞庫進行單克隆分選。用培養基稀釋的細胞培養14天后，于顯微鏡下挑選正確的單克隆提取基因組DNA，利用單克隆測序引物TA1或TA2進行測序。其中所獲得的第23號單克隆缺少了10bp，是一株Mindin基因敲除并可穩定遺傳的細胞。而所獲得的第12號單克隆缺失了3bp，是一種不會改變后續閱讀框的突變，可以用于當作對照組細胞株，見圖1。

圖1 Mindin敲除的單克隆細胞基因組測序結果

3 討論

基因組編輯是研究基因功能以及進行基因治療的重要手段，人工核酸酶技術的出現為基因組編輯提供了強有力的工具。CRISPR/Cas9作為新一代的基因組編輯核酸酶技術，其對靶位點的識別依賴于sgRNA 5’端與靶位點DNA序列間的互補配對，針對不同靶點序列的sgRNA僅需替換識別位點處20bp的序列即可，應用時簡單易行，具有顯著的優勢，成為目前生命醫學領域的研究熱點。

真核生物基因組DNA具有復雜的高級結構，并且組蛋白上經常會發生各種修飾，故而尋找高效的sgRNA位點是確保CRISPR/Cas9系統有效工作的重要前提。為了探究如何獲得高效的sgRNA，在本研究工作中，我們挑選了腸癌抑制基因Mindin作為靶基因，利用已有的設計軟件，構建了針對Mindin基因的三條sgRNA，并將其導入鼠源L929細胞中，檢測sgRNA的效率。結果表明，所挑選的三條sgRNA都能高效的介導基因組編輯，細胞庫內測序的所有克隆都發生了突變，并且突變位點都位于sgRNA后NGG序列附近，證明了這三條sgRNA都可以介導Cas9蛋白高效切割Mindin基因靶序列。從細胞庫中分離得到的不同單克隆細胞株進一步證實了這種基因組編輯可以穩定遺傳的。由此，我們得到了一個穩定敲除Mindin基因的L929細胞株，為后續研究Mindin基因在腸癌發生與發展過程中的作用提供了必要的研究素材。此外，我們設計出的高效sgRNA位點也可用于Mindin基因敲除動物的制備，為其動物模型的建立打下堅實的基礎。

參考文獻：

[1]Barrangou R，Fremaux C，Deveau H，et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.Science 2007；315（5819）1709-12

[2]Cong L，Ran FA，Cox D，et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science，2013，339（6121）：819-823.

[3]盧利莎，白楊，劉鑫，等.利用CRISPR/Cas9技術構建敲除MEIS2基因的HEK293T人胚腎細胞系[J].中國細胞生物學學報，2015，37（4）：535–541

[4]Higashijima，S.i.A.Nose，et al.Mindin/F-spondin Family：Novel ECM Proteins Expressed in the Zebrafish Embryonic Axis[J].DEVELOPMENTAL BIOLOGY，1997，192（2）：211-227.

編輯/肖慧