對(duì)先天性心臟病患者GATA4基因的研究

摘要：目的 對(duì)先天性心臟病患者GATA4基因進(jìn)行研究。方法 分別對(duì)50例先天性心臟病病例及50例對(duì)照組GATA4基因全部外顯子擴(kuò)增并測(cè)序，并借助BLAST程序及Clustal W軟件識(shí)別基因突變及分析突變氨基酸的保守性。結(jié)果 在1例室間隔缺損患者的GATA4基因識(shí)別出1個(gè)雜合錯(cuò)義突變，即V267M突變。這些突變?cè)谡?duì)照者中均不存在，且多物種GATA4序列比對(duì)顯示第267位的纈氨酸在進(jìn)化上高度保守。結(jié)論 GATA4基因的V267M突變與中國(guó)CHD的發(fā)生有一定的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：GATA4；先天性心臟病；基因突變

先天性心臟病是一類因胚胎期心血管系統(tǒng)發(fā)育異常所引起的先天畸形。絕大多數(shù)CHD為遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其中遺傳因素在CHD發(fā)病中起重要作用。GATA4是心臟發(fā)育及形成的主要相關(guān)基因，此基因在種系間具有高度保守，它的單個(gè)或多個(gè)基因的突變，均會(huì)導(dǎo)致心臟畸形的發(fā)生。本研究旨在揭示心臟發(fā)育相關(guān)基因GATA4突變與中國(guó)CHD發(fā)病的關(guān)系，為預(yù)防先天性心臟病的發(fā)生及制訂先天性心臟病防治對(duì)策提供可靠科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2011年1月～6月江西省兒童醫(yī)院心臟中心收治的CHD患者共50例，男27例，女23例；包括室問(wèn)隔缺損（VSD）38例、房間隔缺損（ASD）4例、肺動(dòng)脈瓣狹窄（Ps）1例、法洛氏四聯(lián)征（TOF）1例、復(fù)雜CHD6例，均由手術(shù)證實(shí)。選擇性別、年齡與CHD患者相匹配的正常人50例為對(duì)照組，其中男28例，女22例；均經(jīng)彩色超聲心動(dòng)圖檢查排除CHD。

1.2基因組DNA制備 抽取受檢者外周血2～3ml，采用乙二胺四乙酸（EDTA）鹽抗凝，-80℃保存；使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取外周靜脈血gDNA。

1.3引物設(shè)計(jì) 利用Primer5.0軟件對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中GATA4基因的gDNA序列（登陸號(hào)：NC_000008.1）的外顯子設(shè)計(jì)引物，引物由上海捷瑞生物工程公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.4 PCR擴(kuò)增 50uL PCR反應(yīng)體系中，取DNA模板4ug、上下游引物各2ug，2×Tap PCR MasterMix 26ul，ddH2O 18ul，采用美國(guó)伯樂(lè)公司PT-200DNA擴(kuò)增儀自動(dòng)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃3min，變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min，30個(gè)循環(huán)，終延伸72℃5min。

1.5 DNA測(cè)序 所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均由深圳華大基因公司進(jìn)行純化及測(cè)序。結(jié)果使用BLAST軟件同GenBank中GATA4（NM_002052.3）基因編碼序進(jìn)行比較，不一致者重新3次PCR擴(kuò)增后作正、反義鏈測(cè)序驗(yàn)證。

1.6突變氨基酸的保守性分析 登陸GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取所有序列已知物種基因編碼的氨基酸序列，使用ClustalW軟件對(duì)比分析突變氨基酸的保守性。

2 結(jié)果

2.1識(shí)別出一個(gè)GATA4基因突變 在1例漢族散發(fā)性先天性室間隔缺損患者第3外顯子上發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變，為雜合子突變。突變的等位基因發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換，因腺嘌呤（A）取代鳥嘌呤（G），導(dǎo)致編碼蛋白第267位纈氨酸（val，V）被甲硫氨酸（met，M）取代（V267M），此突變?cè)?0例對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)。見(jiàn)圖1。

圖1：正常對(duì)照者和GATA4基因突變者的部分序列及其編碼蛋白比較

a：同一位點(diǎn)正常對(duì)照者密碼子；b：同一位點(diǎn)CHD患者雜合突變型密碼子（正向測(cè)序）；c：同一位點(diǎn)CHD患者雜合突變型密碼子（反向測(cè)序）；d：正常對(duì)照組及CHD患者編碼蛋白比較；箭頭為突變位點(diǎn)。

2.2 GATA4蛋白同源性比對(duì) 在NCBI中利用BlastP可以得到不同物種間GATA4同源蛋白，將同源性較高的9個(gè)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的序列下載為fasta格式，如：人類（NP_002043）、猩猩（XP_002818845.1）、獼猴（XP_001087008.2）、牛（NP_00117

9806.1）、野豬（NP_999458.1）、犬類（NP_001041577.1），在線應(yīng)用ClustalX2軟件（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）進(jìn)行多序列對(duì)比。結(jié)果顯示GATA4編碼第267位纈氨酸在生物進(jìn)化過(guò)程中處于高度保守，見(jiàn)圖2。

圖2 不同物種間GATA4同源蛋白對(duì)比，結(jié)果顯示GATA4編碼第267位纈氨酸在生物進(jìn)化過(guò)程中處于高度保守（箭頭標(biāo)示）。

3 討論

GATA4基因定位于8p23.1-p22，cDNA全長(zhǎng)3372bp，有6個(gè)編碼外顯子，編碼442個(gè)氨基酸，分別由N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、中部?jī)蓚€(gè)鄰近的鋅指結(jié)構(gòu)域和C端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，此結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys）可與特定DNA結(jié)合，使其在進(jìn)化過(guò)程中保持高度保守[1]。

在心臟分化過(guò)程中，GATA4基因在胚胎嘴側(cè)到尾側(cè)和側(cè)面到腹側(cè)的折疊過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用[2]，實(shí)驗(yàn)表明，GATA4基因敲除的純合子小鼠在心臟發(fā)育過(guò)程中由于胚胎的折疊受到影響，導(dǎo)致原始心管不能正常形成，并形成雙心管而死亡[3]。而其表達(dá)失活的轉(zhuǎn)基因小鼠亦因心臟發(fā)育缺陷常在胚胎發(fā)育的第8～9d死亡[4]。GATA4基因亦可通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)與靶基因啟動(dòng)子的DNA序列元件5'-（A/T）GATA（A/G）-3'集合，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的活性[2]。該基因單個(gè)或多個(gè)突變及異常表達(dá)均會(huì)導(dǎo)致心臟畸形，如：房間隔缺損、室間隔缺損、房室間隔缺損、右心室雙流出道、完全性房室通道、肺動(dòng)脈縮窄、左心發(fā)育不全綜合征、心內(nèi)膜墊缺失、右心室發(fā)育不良、動(dòng)脈導(dǎo)管未閉等[5]。因此，GATA4基因在心臟發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

本研究在1例室間隔缺損患兒GATA4基因識(shí)別出1個(gè)雜合錯(cuò)義突變，經(jīng)過(guò)多次PCR正反向測(cè)序證實(shí)存在于這1例室間隔缺損，但不存在于50例正常對(duì)照組，且突變氨基酸在哺乳動(dòng)物生物進(jìn)化中處于高度保守，提示此突變可能與CHD相關(guān)。V267M突變位于2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域之間，在蛋白激酶A磷酸化位點(diǎn)（S261）附近[4]，因GATA4的兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域可與特定DNA結(jié)合，使其在進(jìn)化過(guò)程中保持高度保守，并能調(diào)節(jié)包括肌凝蛋白重鏈基因、肌凝蛋白輕鏈基因、肌鈣蛋白基因、血管緊張素Ⅱ之I型受體基因、心房利鈉肽基因以及鈉/鈣交換器、M2型膽堿受體、A1型腺苷受體基因等轉(zhuǎn)錄因子的活性[5]。從而推測(cè)這個(gè)突變可能是通過(guò)使鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA4的轉(zhuǎn)錄活性下降，而引發(fā)先天性心臟病。由于本病例的DNA主要是從患者外周靜脈血中血細(xì)胞提取，而血細(xì)胞主要在骨髓中生成，提示該突變可能源自生殖細(xì)胞，有可能細(xì)胞分裂間期復(fù)制時(shí)期遺傳給下一代，因此有必要對(duì)其下一代隨訪，并進(jìn)行產(chǎn)前GATA4基因突變檢查。在江西省尚屬首例發(fā)現(xiàn)[5-6]。因此，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證V267M突變與CHD有關(guān)，是CHD的常見(jiàn)突變，對(duì)CHD的早期預(yù)防、危險(xiǎn)分層、預(yù)后評(píng)估和基因特異性治療提供一定參考依據(jù)。

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