HPLC法測定不同產地桑椹藥材中檸檬酸成分的含量

摘要：目的 建立測定桑椹藥材中檸檬酸含量的方法，并測定其在不同桑椹藥材中的含量。方法 桑椹藥材采用水作為溶劑加熱回流提取，利用HPLC法，采用KromasilC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；使用0.6%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫；流速為0.5ml/min-1；以209nm為檢測波長；柱溫為30℃。結果 檸檬酸對照品在0.10320～1.72000mg/ml-1質量濃度范圍內線性關系良好（r=0.9999）；精密度的RSD值為1.01%（n=6）；測得平均加樣回收率為98.29%，RSD值為0.93%（n=6）。結論 該方法簡便、準確、易行，可用于桑椹藥材的質量控制。

關鍵詞：桑椹藥材；檸檬酸；HPLC法

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A

桑椹，又名桑椹子、桑果、桑子、是桑科桑屬mulberry（Morus alba L.）植物的果實。本屬植物全球約有16種，分布于北溫帶、亞洲熱帶和非洲熱帶及美洲地區。我國約有11種，分布于全國大部分地區，以江蘇、浙江等南方養蠶地區產量較大[1]。1993年國家衛生部把桑椹列為“既是食品又是藥品”的農產品之一[2]。

桑椹中含有豐富的糖類、有機酸、脂類、維生素、色素、非色素酚和礦物質等成分[3]。目前，在桑椹營養成分的研究的基礎上，國內外對桑椹中功效成分的研究較多，主要集中在桑椹色素、非色素酚、及多糖等成分上。檸檬酸是其中含量較高的有機酸[4]，同時其具廣泛的藥理作用：①檸檬能防止心血管動脈硬化并減少血液粘稠度；②中國中醫認為，檸檬性溫、味苦、無毒，具有止渴生津、祛暑安胎、疏滯、健胃、止痛等功能利尿，調劑血管通透性；③檸檬酸熱量低，且具有很強的收縮性，因此有利于減少脂肪，是減肥良藥；④具有防止和消除皮膚色素沉著的作用；⑤袪痰作用等[5-7]。因此，本文建立一種準確定量桑椹藥材中的檸檬酸含量的方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津高效液相色譜儀（Prominence UFLC），日本島津公司；1/10萬電子分析天平，型號ME235S，德國塞多利斯公司；電熱套（1000 ml），上海科析實驗儀器廠；KQ-300DE數控超聲波發生器，昆山超聲儀器有限公司。

1.2試藥 磷酸，AR級，天津市富宇精細化工有限公司；水，自制；檸檬酸（批號111679-200401）對照品，購自中國食品藥品檢定研究院；桑椹藥材：安徽產地（批號20150412、20150415），新疆藥材（批號20150418、20150419、20150421），較廣產地批號（20150422），河南產地（批號20150508），江蘇產地（批號20150428），四川產地（批號20150502），陜西產地（批號20150427）由陜西君碧莎制藥有限公司提供。

2 實驗方法

2.1色譜條件 色譜柱為Kromasil C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.6% 磷酸水溶液；檢測波長：209 nm；流速：0.5 ml/min；柱溫：30℃；進樣量10 μl。

2.2對照品溶液的配制 精密稱取檸檬酸對照品17.2 mg，置10 ml容量瓶，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，超聲并搖勻，濾過，取續慮液，作為母液，備用。

2.3供試品溶液的制備 取樣品粉末（過4號篩）2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水100 ml，稱定重量，加熱回流提取1 h，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4標準曲線及線性范圍 量取母液0.30，0.50，1.00，2.00， 4.00 ml，分別置于5 ml量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，濾過，分別得到濃度為0.10320、0.17200、0.34400、0.68800、1.37600 mg/ml的對照品溶液，按上述條件測定峰面積，以對照品峰面積值（y）為縱坐標，檸檬酸濃度（x）為橫坐標進行線性回歸。結果：檸檬酸的質量濃度范圍（mg/ml）、線性方程及相關系數（r）分別為：線性范圍為0.10320～1.72000 mg/ml，回歸方程為y=1278680x+1614，r=0.9999。結果表明對照品在相應濃度范圍內線性關系良好。

2.5精密度實驗 精密量取線性樣品溶液（濃度為1.72 mg/ml）1.07 ml于5 ml量瓶中加蒸餾水至定容至刻度，得濃度為0.36808 mg/ml，按上述色譜條件重復進樣6次，測得檸檬酸峰面積值的RSD分別為1.01%。結果表明該方法精密度良好。

2.6穩定性實驗 取精密度試驗樣品溶液（濃度為0.36808 mg/ml），每間隔一定時間進樣一次，測定檸檬酸對照品峰面積的RSD值分別為2.28%。結果表明檸檬酸對照品峰面積值在8 h內穩定。

2.7加樣回收實驗 采用加樣回收法，取已測知含量的樣品（江蘇產，批號20150428，含量為5.140%），精密稱取檸檬酸對照品50.00 mg加入其中。按供試品溶液制備法操作，并按上述色譜條件進行測定，計算回收率。檸檬酸平均加樣回收率為98.29%，結果表明本方法具有良好的回收率。

2.8重復性實驗 精密稱取樣品（江蘇產，批號20150428，含量5.140%）2.0000 g，按照供試品方法制備6份樣品，按上述色譜條件進樣測定，結果檸檬酸含量的RSD值分別為0.63%。結果表明本方法穩定。

2.9不同產地桑椹藥材中檸檬酸含量的測定 分別精密量取供試品溶液10 μl，按前述色譜條件進樣，測定峰面積，在此檢測條件下，檸檬酸能夠很好地分離。

3 實驗結果

3.1色譜圖 檸檬酸對照品色譜圖與供試品色譜圖，見圖1、圖2。

3.2 桑椹中檸檬酸的測定結果，見表1。

4 討論

4.1流動相的選擇 實驗中考察了1.0%醋酸與0.6%磷酸2種系統梯度洗脫及其不同流動相比例，比較的磷酸濃度有0.1%，0.3%，0.6%，1.0%水溶液。結果表明，各種流動相中0.6%磷酸水溶液系統為最佳，其圖譜上各個色譜峰的分離度較好，保留時間適中，因此選此流動相系統作為桑椹藥材中檸檬酸含量指標檢測的流動相。

4.2制樣方法 比較了用水作為溶劑超聲提取與用水作為溶劑加熱回流提取。結果表明，用水作為溶劑加熱回流提取得到的峰面積較大、峰個數較多、分離度較好，所以選擇用加熱回流的方式提取。

4.3其他 比較了不同柱溫與流速，柱溫超過30℃分析時間縮短，但大多數色譜峰分離度小或不能分開；流速<0.5 ml/min分析時間過長，>0.5 ml/min大多數色譜峰分離度差。因此選擇便于控制的柱溫30℃與流速 0.5 ml/min作為色譜條件。

綜上所述，通過測定不同產地桑椹藥材中檸檬酸成分含量的研究，表明該方法穩定可靠，單用液相色譜儀即可，避開了液相色譜與質譜連用的限制，使檢測簡單化。由于桑椹藥材中的檸檬酸含量較高，且作用廣泛，可用于桑椹藥材的質量控制。

參考文獻：

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[2]孫波，周洪英，李勇，等.桑椹成分研究進展[J].北方蠶葉，2010，31（1）：4-8.

[3]夏英杰，譚振鵬，王柳萍，等.藥食兩用中藥桑椹的研究進展[J].中國醫藥科學，2013，3（3）：52-54.

[4]張志強，楊清香，孫來華，等.桑葚的開發及利用現狀[J].中國食品添加劑，2009，24（2）：65-68.

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[7]汪多仁.檸檬酸的開發與應用進展[J].精細化工原料及中間體，2011，20（9）：32-35.

編輯/翟辰萬