TGF—α、VEGF在皮膚鱗狀細胞癌中表達及其與微血管密度的相關性研究

摘要：目的 探討轉化生長因子α（TGF-α）及血管內皮生長因子（VEGF）在皮膚鱗狀細胞癌患者皮損血管生成機制中的作用。方法 采用SP免疫組化法檢測皮膚鱗狀細胞癌患者皮損處TGF-α、VEGF及微血管密度（MVD）的表達情況，并以正常人皮膚作對照。結果 皮膚鱗狀細胞癌患者皮損處TGF-α、VEGF的表達及MVD值顯著高于正常對照組（P<0.01）；皮膚鱗狀細胞癌患者皮損中的TGF-α、VEGF表達與MVD呈正相關（r=0.668， r=0.720，均P<0.01），TGF-α與VEGF的表達也呈正相關（r=0.769，P<0.01）。結論 皮膚鱗狀細胞癌患者皮損中TGF-α、VEGF及MVD的表達水平均增高，表明TGF-α及VEGF可能引起皮膚鱗狀細胞癌患者皮損處血管增生，三者在皮膚鱗狀細胞癌皮損的形成發展過程中可能發揮協同促進調節作用。

關鍵詞：皮膚鱗狀細胞癌；TGF-α；VEGF；MVD

Abstract：Objective To explore the effect of TGF-α and VEGF in the mechanism of the angiogenesis of squamous cell carcinoma.Methods SP immunohistochemistry was used to detect the the expression of TGF-α，VEGF and MVD from samples of squamous cell carcinoma tissue. Meanwhile，those factors were detected in normal skin tissue as control. Results The expression of TGF-α，VEGF and MVD in squamous cell carcinoma tissue group were signifcantly higher than those in the normal group （P<0.05）.The expression of TGF-α，VEGF were positively correlated with MVD levels in squamous cell carcinoma tissue group（r=0.668， r=0.720， allP<0.01）， the expression of TGF-α was also positively correlated with VEGF（r=0.769， P<0.01）. Conclusion The expression are increased of. TGF-α，VEGF and MVD in squamous cell carcinoma，they may play positive roles in regulating and facilitating synergy in the lesion specimens of squamous cell carcinoma.

Key words：Squamous cell carcinoma；TGF-α；VEGF；MVD

皮膚鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是由表皮和（或）附屬器角質形成細胞發展演變的一種惡性腫瘤，因此又叫表皮樣癌，具有浸潤性生長特性。目前研究表明，皮膚鱗狀細胞癌皮損處暴露部位微血管密度（MVD）之所以增加，是因為患者過度地接受外界的光刺激，大量地接受紫外線輻射更增加了上皮細胞癌變發生的幾率，上皮癌細胞分泌的血管形成因子是促使血管形成的間接因素，微血管生成異常與SCC的發生、持續存在有密切關系，在SCC的發病機制中起重要作用[1]。體外實驗發現TGF-α可以誘導角質形成細胞產生VEGF，二者可能在血管增生中起協同作用[2]。本研究通過檢測SCC皮損中TGF-α、VEGF、CD34表達，旨在探討TGF-α、VEGF與微血管密度（MVD）相互關系及其在SCC發生中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 2014年1月～2015年10月我院皮膚科門診的SCC患者20例，均經組織病理檢查確診，其中男14例，女6例，年齡35～80（59.7±15.6）歲，病程1月～18.5（6.8±4.9）年。根據Broders病理法判斷分級：I級6例，II級7例，III級7例，1V級0例，所有病例均未發生淋巴結轉移和遠處轉移。正常對照組20例，均為整形外科及骨科手術的非銀屑病患者的皮膚，男12例，女8例，年齡30～78（57.8±13.2）歲，所有標本均有詳細完整的病歷存檔。兩組年齡、性別等均無統計學差異，可以進行統計學分析比較（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1使用試劑 鼠抗人CD34單克隆抗體、兔抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人TGF-α單克隆抗體（所有試劑均有北京中杉金橋生物技術有限公司生產）和即用型SP免疫組化試劑盒也購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2操作方法與評定標準 在皮損處取1cm×1cm大小的標本，深度可達脂肪層，4～5mm厚度。選擇固定液體，濃度為10%的中性福爾馬林液，容量一般為標本體積的10～20倍，用石蠟將包埋，然后切片，SP免疫組化染色，可以根據試劑盒內的說明書來進行操作。對TGF-α、VEGF進行染色處理，要確保在每張切片上都能對TGF-α、VEGF進行整體觀察，可以選擇5個代表性區域，每區200個細胞，在400×倍視野下進行觀察。陽性細胞數計分標準：陽性數不超過5%的比例計為0；陽性數在6%～35%計為1；陽性數在36%～70%計為2；陽性數超過70%的比例計為3。著色強度計分標準：0為不著色，1為弱著色（淡棕黃色），2為強著色（顯著棕黃色）。陽性分級標準：上述兩項相加，≤2分為陰性（-），3分為弱陽性（+），4 分為中等陽性（++），5分為強陽性（+++）。MVD：染色后呈棕黃或棕褐色、分界清楚的內皮或內皮細胞團簇均可以作為一個血管計數，在100倍光鏡下，對每張切片選擇血管分布最高區域者，在200倍光鏡下，選擇5個視野，計算微血管的個數，并計算其平均值，得出單位面積的MVD值。

1.3統計學處理 使用SPSS 11.0統計學軟件對數據進行統計學分析處理，計量資料以（x±s）的形式表示，組間數據比較采用隨機t檢驗，組內數據比較采用配對t檢驗；數據的相關性分析用Sperman處理。

2 結果

2.1 SCC皮損中與正常皮膚組織中TGF-α和VEGF表達結果的比較：TGF-α在細胞質中表達的量較大，在細胞核中少量表達，在SCC皮損中的表達強度與正常皮膚組織中的表達強度比較差異，具有統計學意義（P<0.05），在SCC組各層皮損中有強陽性表達，而在正常皮膚組織中各層均為弱陽性表達，表達的強度都明弱于SCC組。VEGF主要位于表皮全層的角質細胞，而真皮淺層血管內皮細胞及其周圍部分炎細胞胞漿，在正常人皮膚中VEGF亦有表達，但表達弱，VEGF 在銀屑病中的表達為強陽性，高于正常對照組（P<0.005）。20例SCC皮損組織中TGF-α陽性表達率為90.0%（18/20）與正常皮膚對照組之間陽性表達率10.0%（2/20）比較差異有統計學意義（χ2=25.60，P<0.01）；SCC皮損組織中VEGF陽性表達率為85.0%（17/20）與正常皮膚對照組之間陽性表達率15.0% （3/20）之間差異具有統計學意義（χ2=19.60，P<0.01）；見表1。

2.2皮損組與正常對照組中CD34和MVD的比較：CD34在真皮淺層小血管內皮細胞胞漿中表達，呈環狀或條狀，彌漫分布，正常對照組的CD34與SC皮損組CD34在真皮層中血管內皮細胞胞漿中的表達均呈陽性；皮損組MVD計數為（25.76±5.86），明顯高于正常對照組的（7.25±2.79），兩組比較具有統計學差異（t=12.75，P<0.01）。

2.3 SCC皮損中TGF-α、VEGF與MVD相關性：SCC患者皮損中的TGF-α、VEGF表達與MVD呈正相關（r=0.668， r=0.720，均P<0.01），TGF-α與VEGF的表達也呈正相關（r=0.769，P<0.05）。

3 討論

皮膚鱗狀細胞癌起源于表皮或其附屬器角質形成細胞（keratinocyte，KC）的皮膚惡性腫瘤，其病因復雜，約占皮膚惡性腫瘤的60%左右，發病機制尚不十分清楚。皮膚鱗狀細胞癌微血管異常包括真皮淺層明顯的微血管擴張，內皮細胞增殖及血管生成。原發皮膚腫瘤的新生血管化程度與腫瘤侵襲性及預后存在相關性，為一獨立的預后因素。在眾多引起血管生成的誘導劑中，血管內皮生長因子（VEGF）是目前發現的一類作用最強，特異性最高的促新生血管形成因子，它是內皮細胞選擇性的有絲分裂原，對內皮細胞具有特異性，可改變內皮細胞的基因表達，特異性引起血管內皮細胞分裂增殖、通透性增加，促進內皮細胞、單核細胞遷移，誘導血管生成及炎細胞浸潤，從而誘導血管生成及炎癥反應[3，4]。Maiolino等[5]檢測犬皮膚SCC中VEGF的表達情況，在所有SCC中都發現有VEGF的存在，提示VEGF可能成為評估皮膚SCC腫瘤惡性程度和生長潛力的重要指標。TGF-α是表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）家族的重要成員之一，編碼基因定位于2號染色體，是EGFR的配體，由角質形成細胞生成，可以自分泌的方式與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）結合促進角質形成細胞的有絲分裂，其作用是刺激上皮細胞增生并誘導組織細胞生長及轉化作用。RT-PCR研究發現在SCC和BCE的鄰近表皮（距腫瘤邊緣2～3mm的表皮）內TGF-α mRNA表達是正常皮膚的2.0～2.7倍；SCC中瘤組織TGF-α mRNA表達是正常皮膚的4.9倍，而其在BCE中表達僅為正常皮膚的78%，TGF-α在SCC中的高表達為其生長提供了基礎[6]。CD34抗原是一種階段特異性白細胞分化抗原，作為普遍認同的細胞標記物，它存在于血管的內皮。因此，能夠很清晰地把毛細血管的形態顯示出來，使用CD34來標識血管內皮，能夠測算出MVD，而MVD又能夠反應出新生的微血管的增長態勢，能對血管的生成進行定量計算，CD34在眾多血管內皮細胞標記物中比較敏感，更具有特異性，觀察也比較方便[7]。TGF-α、VEGF可以旁分泌或自分泌方式影響腫瘤的生長與轉移，許多皮膚腫瘤可產生TGF-α、VEGF，但皮膚腫瘤中TGF-α、VEGF表達及其與MVD的關系研究較少。

本研究結果表明，正常人表皮各層均有TGF-α弱表達，誘導表皮細胞正常的生長及轉化。在SCC組織表皮各層中的表達強度均顯著強于正常對照組，提示TGF-α通過自分泌調節方式刺激和加速角質形成細胞的形成和生長，表明TGF-α在SCC的發展和持續過程中可能起著一定的作用。其機制可能是[8]：EGFR效應器（Erk1/2、Akt）激活見于SCC癌細胞和SCC、BCE鄰近表皮，表達過度的EGFR和存在過量的TGF-α互相發生作用，EGFR和TGF-α相結合后的受體結構產生二聚體化和自身磷酸化效應，EGFR被活化，同時激活下游的信號傳導通路，受體上的酪氨酸激酶（PTK）也被激活，然后再激活MAPK信號系統，信號傳導因子細胞外調節蛋白激酶（EPK）通路被激活，然后進入細胞核，使得轉錄因子被磷酸化，DNA合成增加，促使細胞發生分化增殖，EGFR信號轉導參與化學物質和癌基因誘導的皮膚癌變。我們的實驗也發現，在SCC患者皮損中血管內皮細胞和正常人表皮角質形成細胞同時表達VEGF，在SCC組織表皮各層中的表達強度均顯著強于正常對照組，提示VEGF在SCC的發病機制中起到了重要的作用。張錫寶等[9]研究表明 VEGF 在 PS 患者皮損及非皮損中的角質形成細胞中過度表達，而在正常人中幾乎未見表達，且與 PS 的病期及疾病嚴重程度有關，與我們的研究結果相符。SCC中VEGF介導的血管生成過程機制可能是：①角蛋白細胞（Keratinocytes，KC）在受到缺氧等各種刺激后通過自分泌或旁分泌釋放細胞因子，促進VEGF表達，同時缺血缺氧也能導致VEGFR數量增加和功能增強，又由于有正反饋作用，VEGF的濃度增高又上調了VEGFR 的表達。當高濃度的VEGF與VEGFR結合后，通過絡氨酸激酶介導的信號轉導使胞內發生一系列改變，促使血管通透性增加及血管內皮細胞增生、遷移，最終導致新生血管形成[10]；②EGF與血管內皮細胞上的特異性受體Fit-1和激酶插入嵌合受體（kinase insert domaincontaining receptor，KDR）結合，激活受體內的酪氨酸激酶，引起一系列信號傳導，促使血管通透性增加及血管內皮細胞增生、遷移，最終導致新生血管形成[11]。本研究結果還顯示，SCC患者皮損中MVD值較低正常對照組顯著升高。SCC皮損中TGF-α、VEGF表達與MVD相關性結果顯示，TGF-α和VEGF的表達與MVD值呈明顯正相關，TGF-α與VEGF的表達也呈正相關，表明SCC患者皮損中TGF-α和VEGF可能發揮協同作用，促進血管新生從而促進SCC的發生。

總之，對SCC血管生成的研究有助于揭示SCC的發病機制，并指導臨床治療。綜合我們的研究結果表明，檢測TGF-α、VEGF與CD34在SCC皮損中的表達以及與MVD的相關性研究，對進一步了解SCC血管生成情況以及為抗SCC新藥開發提供新的藥物靶位。

參考文獻：

[1]張捷，王建力，陳莉.皮膚鱗狀細胞癌中上皮性鈣黏著蛋白表達與微血管密度的相關性[J].中華皮膚科雜志，2006，39（11）：658-659.

[2]Wang Y，Crisostomo PR，Wang M，et al.TGF-alpha increases human mesenchymal stem cell-secreted VEGF by MEK-and PI3-K-but not JNK-or ERK-dependent mechanisms[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2008，295（4）：1115-1123.

[3]Nakopoulou L，Stefanaki K，Panayotopoulou E，et a1Expression of the vascular endothelial growth factor receptor-2/Flk-1 in breast carcinomas：correlation with proliferation[J].Hum Pathol，2002，33（9）：863-870.

[4]Dvorak HF，BrownLF，Detmar M，et al.Vascular permeability factor vascular endothelial growth factor，microvascular hyperpermeability，and angiogenesis[J].Am JPathol，1995，146（3）：1029-1039.

[5]Maiolino P1，De Vico G，Restucci B.Expression of vascular endothelial growth factor in basal cell tumours and in squamous cell carcinomas of canine skin[J].J Comp Pathol，2000，123（2-3）：141-145.

[6]RittiéL，Kansra S，Stoll SW，et al.Differential ErbB1 signaling in squamous cell versus basal cell carcinoma of the skin[J].Am J Pathol，2007，170（6）：2089-2099.

[7]Fieger CB，Sassetti CM，Rosen SD.Endoglycan，a member of the CD34 family，function as an L-selection ligand through modification with tyrosine Sulfation and sialyl Lewis x[J].J Biol Chem，2003，278（30）：27390-27398.

[8]RittiéL，Kansra S，Stoll SW，et al.Differential ErbB1 signaling in squamous cell versus basal cell carcinoma of the skin[J].Am J Pathol，2007，170（6）：2089-2099.

[9]張錫寶，羅權，吳志華，等.血管內皮生長因子及其受體在銀屑病發病中的作用及意義[J].中華皮膚科雜志，2005，38：140-142.

[10]Takahashi H，Tsuji H，Hashimoto Y，et al.CELL PROLIFERATION AND CYTOKINE INDUCTION BY TNF-alpha OF PSORIATIC KERATINOCYTES ARE NOT DIFFERENT FROM NORMAL KERATINOCYTES IN VITRO[J].Indian J Dermatol，2009，54（3）：237-239.

[11]Detmar M.The role of VEGF and thrombospondins in skin angiogenesisa[J].J Dermatol Sci，2000，24（1）：S78-84.編輯/成森