探討生化分析中化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用

（淮南師范學(xué)院，安徽 淮南 232000）

【摘要】：化學(xué)發(fā)光分析方法是一種根據(jù)發(fā)光反應(yīng)對化學(xué)發(fā)光物質(zhì)由激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時所發(fā)出的光信號盡心測量的方法。這種方法具有操作便捷、分析速度快、智能化的實現(xiàn)性高以及結(jié)果較精確等優(yōu)勢。化學(xué)發(fā)光在醫(yī)療等領(lǐng)域有較為廣泛的應(yīng)用。本文主要對化學(xué)發(fā)光技術(shù)在DNA、生物酶、以及蛋白質(zhì)檢測等等中的應(yīng)用進行了論述。

【關(guān)鍵詞】：生化分析；化學(xué)發(fā)光；應(yīng)用

化學(xué)發(fā)光是一種物質(zhì)在進行化學(xué)反應(yīng)時發(fā)生的光輻射現(xiàn)象。化學(xué)發(fā)光包括直接和間接發(fā)光兩種。從本質(zhì)上來說，化學(xué)發(fā)光分析方法主要是根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，對化學(xué)發(fā)光物質(zhì)由激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時所發(fā)出的光信號進行測量的方法。化學(xué)發(fā)光從魯米諾化學(xué)發(fā)光試劑的產(chǎn)生到如今，歷經(jīng)了一百多年的發(fā)展，奠定了其在生化分析中的重要地位。

一、化學(xué)發(fā)光簡介

目前最常用的三個化學(xué)發(fā)光體系分別為魯米諾-H2O2、四價錳離子和聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光體系。

1、魯米諾-H2O2

魯米諾是最常用的化學(xué)發(fā)光劑。最早在20世紀20年代末時，國外學(xué)者將H2O2加入到魯米諾堿性溶劑，發(fā)現(xiàn)會產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)并有微弱的藍色發(fā)光現(xiàn)象。而加入HRP類的催化劑或者氧化劑時，反應(yīng)強度也會相應(yīng)增加。DNA酶也具有催化能力，例如氯高鐵血紅素/G-四聯(lián)體DNA酶能夠?qū)︳斆字Z-H2O2反應(yīng)進行催化，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。目前DNA酶已經(jīng)形成了多種化學(xué)發(fā)光體系并被應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄因子、金屬離子以及生物酶活性等的檢測。

2、四價錳離子

雖然作為化學(xué)發(fā)光劑，酸性KMnO4的應(yīng)用時間和范圍都具有優(yōu)勢，但四價錳化合物被作為化學(xué)發(fā)光劑的使用卻較少。固體MnO2首次被作為化學(xué)發(fā)光劑檢測異煙肼是在20世紀90年代末，但其應(yīng)用范圍非常有限，原因是MnO2無法溶于水。進入21世紀，國外學(xué)者第一次使用Mn4+，將其作為化學(xué)發(fā)光劑來對嗎啡和可卡因進行檢測。具體來說，是將溶解于H3PO4和甲醛當中的Mn4+作為化學(xué)發(fā)光劑。

3、聯(lián)吡啶釕電化學(xué)

ECL也就是電致化學(xué)發(fā)光是先對電極施加電壓造成電化學(xué)反應(yīng)，繼而引起高能級電子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而使得化學(xué)發(fā)光發(fā)生。電致化學(xué)發(fā)光的特點主要包括背景干擾小、發(fā)光空間和時間可控等。三價聯(lián)吡啶釕是目前應(yīng)用范圍最廣的電致化學(xué)發(fā)光劑。聯(lián)吡啶釕化合物在穩(wěn)定性、發(fā)光效率等方面具有很大的優(yōu)勢，而且還可重復(fù)激發(fā)，并且電化學(xué)可逆。但由于其在水中易氧化，不穩(wěn)定，因此應(yīng)用范圍受到限制。

二、化學(xué)發(fā)光與其他技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用

由于單一的化學(xué)發(fā)光分析在抗干擾性等方面存在缺陷，因此一般和其他技術(shù)聯(lián)合使用。

1、以非擴增技術(shù)為基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光分析

以非擴增技術(shù)為基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光分析主要包括以高效液相色譜、毛細管電泳、量子點和微流體芯片以及微陣列為基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光分析。高效液相色譜與化學(xué)發(fā)光分析聯(lián)合使用，綜合了二者的優(yōu)勢，具有高靈敏度和高效率的特點，但不足之處在于動態(tài)范圍較窄；毛細管電泳法與高效液相色譜相比，動態(tài)范圍變寬，而且能達到分離速度快、分離效果好的結(jié)果；量子點法作為新型發(fā)光材料，具有量子產(chǎn)率高、光學(xué)穩(wěn)定性好以及寬激發(fā)窄發(fā)射等優(yōu)勢；微流體芯片以及微陣列使得化學(xué)發(fā)光分析的微型化趨勢更加明顯，同時具有攜帶方便、分析成本低以及分析速度快的優(yōu)勢。

2、以擴增技術(shù)為基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光分析

將化學(xué)發(fā)光與核酸擴增技術(shù)結(jié)合起來使用能夠使檢測結(jié)果更精確。等溫擴增是一項以酶促反應(yīng)為基礎(chǔ)的核算擴增技術(shù)。該技術(shù)主要包括鏈置換擴增、滾環(huán)擴增、等溫指數(shù)擴增以及切口酶信號擴增等等。由于等溫擴增的發(fā)生對于溫度的要求并不是很高，在反應(yīng)過程中不需要對溫度進行嚴格控制，因此以擴增技術(shù)為基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光分析具有擴增流程簡單且時間較短的優(yōu)勢。

三、化學(xué)發(fā)光在生化分析中的應(yīng)用

1、對DNA進行檢測

核酸分析在現(xiàn)代生物科學(xué)領(lǐng)域中占據(jù)著不可缺少的重要位置。目前使用最廣泛的核酸分析基本上都需要標記技術(shù)，例如電化學(xué)分析中的二茂鐵以及其他氧化還原標記，還有光學(xué)分析中的熒光標記。由于化學(xué)發(fā)光分析在操作流程、成本等方面有較強的優(yōu)勢，因此在DNA檢測中被廣泛應(yīng)用。最常用的例如聯(lián)合使用顏色不同的量子點和DNA酶催化的化學(xué)發(fā)光，以此對多種DNA進行同時檢測。這種檢測方法主要是使用CRET促成量子點發(fā)光，使得檢測結(jié)果更精確。

2、對生物小分子進行檢測

二硫化物和低分子量硫醇也在細胞的氧化還原反應(yīng)中起著重要作用。與傳統(tǒng)的樣品處理方法相比，HPLC和Mn（IV）化合物介導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光克服了分析物降解或者氧化的弊端，提高了檢測結(jié)果的精確度。具體來說，二者結(jié)合能夠?qū)ρ褐械腃SH和GSSG進行快速檢測。部分學(xué)者設(shè)計了兩條DNA，一條含有DNA酶序列，另一條含有抗ATP適配體序列，并在ATP檢測過程中將基于DNA酶催化的化學(xué)發(fā)光共振能量進行利用。在ATP存在的情況下，就會形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，從而生成化學(xué)發(fā)光。

3、對生物酶活性進行檢測

以往的端粒重復(fù)序列擴增技術(shù)在檢測端粒酶方面具有耗時長以及檢測流程繁瑣的缺陷，因此將化學(xué)發(fā)光與兩級等溫擴增相結(jié)合，免去了分離和洗滌的環(huán)節(jié)使得檢測時間更短、操作更靈活，而且檢測結(jié)果更靈敏，結(jié)果更精確。此外，還有一種能使引發(fā)指數(shù)擴增的方式，那就是利用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶。設(shè)計具有一定規(guī)則的環(huán)狀DNA模板，在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶存在時能夠使得指數(shù)擴增并產(chǎn)生大量的DNA酶，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。

4、對蛋白質(zhì)進行檢測

轉(zhuǎn)錄因子是一種與糖尿病、癌癥等疾病關(guān)系較為密切的DNA結(jié)合蛋白。使用化學(xué)發(fā)光與等溫指數(shù)擴增相結(jié)合的方法，對轉(zhuǎn)錄因子NF-kB p50進行超靈敏檢測。同時使用轉(zhuǎn)錄因子和探針，能夠使外切酶III不發(fā)生切割，然后在T7 RNA聚合酶的作用下產(chǎn)生大量RNA引物，并使等溫指數(shù)擴增，DNA酶順勢產(chǎn)生，從而促使化學(xué)發(fā)光的發(fā)生。

5、對金屬離子進行檢測

對金屬離子進行檢測的最典型表現(xiàn)為將化學(xué)發(fā)光應(yīng)用于Hg2+的檢測。設(shè)計兩個分別包含DNA酶亞基I和II以及胸腺嘧啶識別位點的亞基III和IV的DNA探針。胸腺嘧啶位點的作用是對Hg2+進行識別，亞基III和IV中含有部分互補序列。Hg2+能使得亞基III和IV形成T-Hg2+-T復(fù)合物，從而兩個探針自動形成穩(wěn)定G-四聯(lián)體，并催化產(chǎn)生魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光。

結(jié)束語：

化學(xué)發(fā)光分析在檢測方面具有耗時短、成本低、檢測效率高以及檢測結(jié)果精確的優(yōu)勢，因此在很多領(lǐng)域尤其是醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測方面得到了廣泛應(yīng)用。尤其是在毛細管電泳、等溫擴增等技術(shù)與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合之后，化學(xué)發(fā)光技術(shù)克服了以往技術(shù)中存在的抗干擾能力差等缺陷，檢測方式更便捷，檢測過程更容易，因此其應(yīng)用前景更加光明。

參考文獻：

[1]李小花.納米金屬氧化物催化魯米諾化學(xué)發(fā)光新體系的研究及其應(yīng)用[D].陜西師范大學(xué)，2013.

[2]肖勤，林金明.化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的應(yīng)用研究進展[J].分析化學(xué)，2015，（06）：929-938.

[3]趙建文，陳艷寧，路士州.化學(xué)發(fā)光免疫檢測儀涉及的關(guān)鍵技術(shù)[J].發(fā)光學(xué)報，2012（12）：1381-1388.