SlCBL1基因調控番茄果實成熟發育的分子機理

王媛花，賈思振，顏志明，馮英娜

(1 江蘇農林職業技術學院，江蘇鎮江 212400；2 江蘇現代園藝工程技術中心，江蘇鎮江 212400)

SlCBL1基因調控番茄果實成熟發育的分子機理

王媛花1,2，賈思振1,2，顏志明1,2，馮英娜1,2

(1 江蘇農林職業技術學院，江蘇鎮江 212400；2 江蘇現代園藝工程技術中心，江蘇鎮江 212400)

以番茄(SolanumlycopersicumL.)品種‘Micro Tom’為試材，從其果實中克隆得到番茄類鈣調磷酸酶B基因(Tomato Calcineurin B-Like gene，SlCBL1)，構建其帶有報告基因的e-GFP植物表達載體，分析番茄果實中SlCBL1基因超表達與成熟發育進程的相互關系。結果顯示：(1)與對照非轉基因植株以及轉空載植株相比，轉SlCBL1基因番茄中SlCBL1基因過量表達，而且能夠使番茄果實成熟期提前3～5 d，表明SlCBL1基因可促進番茄果實成熟。(2)番茄果實成熟相關基因的表達量也受到不同程度調控，其中番茄成熟過程中的色素合成基因、乙烯路徑基因以及果實成熟相關轉錄因子都受到強烈的調控，與對照相比表達量分別上調5～10倍。研究表明，SlCBL1基因能夠促進番茄果實成熟，而且通過影響色素合成基因以及果實成熟相關轉錄因子來調控番茄果實成熟。

番茄‘Micro Tom’；SlCBL1基因；果實發育

類鈣調磷酸酶B基因(Calcineurin B-Like geneCBL)家族是一類鈣感應器。CBL基因最初在擬南芥中克隆出來，同酵母中鈣調磷酸酶B和動物中的神經鈣調傳感器非常相似，因此被命名為類鈣調磷酸B[1]。后來在玉米、水稻、豌豆、大豆和大麥中也發現有CBL基因[2-3]。CBL1基因是目前CBL基因家族中研究得最多的基因，有研究推測其有可能是植物中執行Calcineurin B亞基功能的鈣結合元件[4-6]。對CBL1基因的研究大多是關于該基因在非生物脅迫，包括鹽、低溫、ABA、干旱中的作用。近年來，多個物種中的CBL1基因已被成功分離并進行了功能驗證[7-12]。研究發現CBL1基因在不同逆境脅迫與生長發育過程中呈現不同的表達模式，是植物逆境信號傳導途徑中的關鍵調控節點[13-15]。

但是，目前的研究只能夠充分說明CBL1基因的功能在于調控植物的抗逆性，而CBL1基因對植物的生長發育的調控研究極少，尤其是對果實的生長發育調控研究幾乎沒有。因此，果實中是否有CBL1基因？如果有，基因功能是什么？是否能夠調控果實的生長發育？這些問題是未來研究CBL1基因功能的一個新的方向，不僅對深入解析果實發育及成熟調控的分子機理具有參考價值，同時對深入理解植物抗逆的機理及其分子改良也具有重要的意義。

番茄(SolanumlycopersicumL.)是一種重要的園藝作物，研究番茄的果實成熟發育近年來取得了最深入系統的成果[16-18]。探討番茄果實成熟的調控機制可為定向改善番茄果實品質提供理論依據。‘Micro Tom’是番茄的矮化突變體，它保留了普通番茄作為模式植物的基本特征，但植株矮小、生命周期更短，具有節省研究空間、縮短研究時間的巨大優勢[19]。所以更易于在實驗室可控環境條件下觀察，可以進行大量取樣記錄和拍照，確定番茄果實成熟發育的進程。本研究克隆了‘Micro Tom’番茄果實基因CBL1，以番茄‘Micro Tom’為材料轉CBL1基因，使CBL1基因在番茄果實中過量表達。通過轉基因材料和對照果實的發育進程以及果實相關成熟基因的表達分析，探究番茄CBL1基因在果實成熟發育中的作用，為深入了解果實發育和成熟調控的分子機理提供思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2014年5月～2016年3月，在江蘇農林職業技術學院組培中心和連棟溫室進行。番茄品種‘Micro Tom’種子購買自美國Ball Horticultural Company。挑選生長飽滿的種子在超凈工作臺用70%乙醇沖洗30 s，無菌水沖洗2次，10%次氯酸鈉消毒8 min，無菌水沖洗3次，接種于1/2MS培養基中，培養番茄無菌苗，15 d以后，選取幼嫩平展的子葉用于基因轉化。

轉基因番茄和普通番茄栽培于蛭石和營養土混合物(1∶1)的培養缽中，栽培于溫室中，溫室環境溫度為白天23～26 ℃，夜間15～18 ℃，相對空氣濕度80%以上。培養至番茄開花時開始觀察不同發育時期的番茄果實發育情況，以及取樣進行后期基因表達量檢測。

1.2 主要培養基配方

番茄種子培養基(1/2MS培養基)：1/2MS +20 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂；番茄共培養培養基(MS1)：MS+20 g/L蔗糖+ 5.5 g/L瓊脂 +2.0 mg/L ZT +0.5 mg/L IAA；番茄篩選培養基(MS2)：MS+20 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂 +2.0 mg/L ZT +0.5 mg/L IAA，高壓滅菌，冷卻至60 ℃加入75 mg/L卡那霉素、400 mg/L羧芐青霉素，分裝培養瓶備用；番茄生根篩選培養基(MS3)：1/2MS+20 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂，高壓滅菌，冷卻至60 ℃加入50 mg/L卡那霉素，350 mg/L羧芐青霉素，分裝培養瓶備用。所有培養基pH值均調至5.8。

1.3 試驗方法

1.3.1 番茄果實發育不同時期CBL1基因表達量的檢測 按照‘Micro Tom’番茄果實的發育周期，在本實驗室的溫濕度條件管理下，果實從開花到完全成熟大約40～42 d。將‘Micro Tom’番茄果實分為小綠果(花后10～12 d)、中綠果(花后16～18 d)、大綠果(花后22～24 d)、綠白果(花后28～30 d)、白果(花后34～36 d)、白轉紅(花后36～38 d)、黃紅果(花后38～40 d)、全紅果(花后40～42 d)等8個時期。

分別提取每個時期果實的RNA，反轉錄為cDNA。根據NCBI數據庫中的番茄SlCBL1基因序列(GenBank登錄號NM_001252118.1)，在Primer3Plus網站設計目的基因SlCBL1基因熒光定量的引物(表1)。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，檢測SlCBL1基因相對表達量。qRT-PCR用ABI公司的熒光定量Steponeplus儀操作，SlCBL1基因和內標Actin基因總反應體系為10 μL，包括3.5 μL super Mix，2 μL Primer Mix (10 μmol/L)，1 μL cDNA，3.5 μL無核酸污染的ddH2O，反應程序：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火 30 s，40個循環后程序結束，用 Stepone2.3軟件分析基因相對表達量。

1.3.2 目的基因克隆和表達載體構建 使用TAKARA公司的RNA提取試劑盒，提取番茄果實的RNA，反轉錄獲得cDNA，根據NCBI數據庫中的番茄SlCBL1基因序列，用DNAMAN軟件設計目的基因SlCBL1基因全長引物(表1)，PCR擴增獲得SlCBL1基因全長序列。將SlCBL1基因正向構建于gateway系列表達載體pK7WG2D上，構建得到載體pK7WG2D-SlCBL1載體(以下簡稱p-SlCBL1載體)。構建好的載體轉化農桿菌EHA105，穿刺保存于4 ℃冰箱，用于后續番茄的穩定轉化。

1.3.3 番茄穩定轉化與轉基因植株鑒定 (1)穩定轉化。將含質粒pK7WG2D(空載)和p-SlCBL1的農桿菌EHA105在LB培養基上(含50 mg/L SPR和50 mg/L Rif)劃板，28 ℃培養2 d，挑取平板上長得好的單菌落，接種到50 mL液體LB培養基中，28 ℃、2 200 r/min 在搖床中振蕩培養至OD600為0.4，常溫下，5 000轉離心8 min，去掉上清液，在無菌濾紙上倒扣離心管，盡量將上清液去除后用MS液體培養基懸浮沉淀菌體，振蕩培養活化菌液，至菌液OD600值為0.2～0.3后備用。

將15 d葉齡的番茄組培苗，沿葉脈將葉片剪成大約3 mm2葉塊。將活化好的菌液倒入剪好的葉片中，輕微搖勻，浸染30 min。倒出菌液，葉片放置于無菌濾紙上吸干表面的菌液。侵染后的葉片接種于番茄共培養基MS1中，24 ℃培養箱中黑暗共培養3 d。完成共培養的番茄葉片，接種番茄篩選培養基MS2上，使傷口與培養基充分接觸，在培養室中(25±2)℃，光照培養。大約40 d左右，可分化出抗性芽，將抗性芽轉入番茄生根篩選培養基MS3上生根。獲得完整的抗性苗。

(2)轉基因植株鑒定。載體pK7WG2D和 p-SlCBL1上均攜帶超強表達的綠色熒光蛋白基因(eGFP)，番茄葉片切口部位長愈傷組織時，將培養瓶放在體式熒光顯微鏡下，抗性植株愈傷組織有明顯的綠色光發出。愈傷組織分化出芽以后抗性植株的芽在熒光顯微鏡下發綠光，而非抗性植株發紅光，可以直接將抗性植株篩選出來。將抗性植株移栽后可用體視熒光顯微鏡再次分別檢測番茄的不同組織器官的熒光。熒光檢測的同時，用PCR法檢測CaM-35s啟動子序列，并且用RT-qPCR方法檢測目的基因SlCBL1的表達量。通過以上3種方法檢測，確認基因轉化成功。

表1 實時熒光定量 PCR所用引物序列

表2 番茄果實成熟發育相關基因

1.3.4 轉基因番茄的SlCBL1基因功能分析 將經檢測后獲得的10個轉基因株系的番茄，在生根培養基中生根后移栽大田，開花結果之后收取T1代轉基因種子。T1收取的種子經低溫春化處理之后，同一時間將轉空載、轉SlCBL1基因和非轉基因的種子播種于直徑18 cm的育苗盆中，基質按照泥炭土和蛭石1∶1的比例混勻使用。番茄培養在白天溫度25～28 ℃，夜間15～18 ℃的溫室中。

(1)轉基因番茄果實發育進程：觀察番茄果實生長過程，從播種到開花結果，每天拍照記錄，觀察轉SlCBL1基因番茄和空載對照以及非轉基因對照的表型差異以及果實成熟時間差異。

(2)轉基因番茄與成熟相關基因的表達量變化分析：用RT-qPCR方法檢測轉SlCBL1基因番茄與空載對照相比較，在果實發育不同3個階段(綠果期花后22 d、白果期花后34 d、紅果期花后40 d)的成熟相關基因表達量變化。共選取與番茄成熟相關的基因22個，基因名稱、基因功能以及NCBI登錄號見表2，qRT-PCR引物見表1。表達量按照上調下調倍數的方式，以不同顏色作為表達量上調或者下調的倍數。

1.4 數據統計分析方法

所有基因表達量采用2ΔΔCt法來計算相對表達量。番茄不同發育時期的SlCBL1基因相對表達量以第一個時期綠果期為對照。轉基因番茄的22個成熟相關基因的表達量均以空載對照植株的相應基因表達量為對照。

2 結果與分析

2.1 番茄果實發育不同時期SlCBL1基因表達量的檢測

番茄果實發育的8個不同時期SlCBL1基因的表達量檢測顯示，在綠果期SlCBL1基因表達量變化不大，基本維持在一個水平。隨著果實成熟，果實向綠白期過渡時，SlCBL1基因表達量急劇上升，在果實發育至白果期時，SlCBL1基因表達量達到最高。而后，隨著果實變色轉紅，SlCBL1基因表達量又會很快下降，到果實成熟完全變紅后SlCBL1基因表達量降到最低(圖1)。這個結果初步說明，在番茄果實成熟過程中，SlCBL1基因有調節成熟的作用，而且在綠果期是正向調節果實成熟的，而隨著番茄果實轉色變紅，表達量會急劇下降。

2.2 目的基因克隆和表達載體構建

根據NCBI數據庫中的番茄SlCBL1基因序列(GenBank登錄號NM_001252118.1)，SlCBL1全長641 bp，設計引物克隆SlCBL1基因。克隆得到的基因片段大小與慕斯基因片段大小一致(圖2)，對基因進行測序分析，測序結果和NCBI數據庫中的SlCBL1基因序列比對后一致性為100%。為了縮短后期轉基因植株的篩選檢測時間，以及檢測時更加便利，選擇了gataway系列植物表達載體pK7WG2D。pK7WG2D載體上攜帶有超表達報告基因e-GFP(圖2)，便于后期的轉基因植株的檢測。

2.3 番茄穩定轉化與轉基因植株鑒定

本試驗中用到的載體比較特殊，因此轉基因周期較短。得到完整的轉基因植株需要150 d左右。圖3，A～D是從開始轉基因、愈傷組織生長、植株生長到結果的全過程。過程中，在體式熒光顯微鏡下檢測熒光，可以將大部分非轉基因植株去除，留下熒光下綠色的植株繼續做后期檢測，確認轉基因是否成功。圖3，E～H分別是轉基因植株的愈傷組織、花和果實的熒光照片。轉基因成功的植株，能夠在發育的不同階段檢測到熒光。圖3，H中，將非轉基因的果實和轉基因果實放置于熒光顯微鏡下，非轉基因果實為紫紅色，而轉基因植株為綠色，通過熒光檢測能夠初步確定轉基因成功。

熒光檢測后，必須通過分子檢測進一步確認轉基因成功。因為番茄本身有SlCBL1基因，因此選取了載體上35S啟動子進行檢測，檢測結果顯示(圖4，A)，轉基因的10個株系，以及轉空載體的1個株系中均有35S基因表達，而非轉基因植株中沒有表達。進一步對SlCBL1基因本身的表達量進行檢測，檢測結果表明(圖4，B)，SlCBL1基因超表達的10個轉基因株系中的SlCBL1基因表達量都顯著高于空載對照和非轉基因植株。通過以上結果能夠確認SlCBL1基因已經成功轉入番茄中。

SGF.小綠果；MGF.中綠果；BGF.大綠果；GWF.綠白果；WF.白果；WRF.白轉紅；YRF.黃紅果；RF. 全紅果.圖1 番茄果實不同發育階段SlCBL1基因表達水平SGF. Small green friut；MGF. Middle green friut；BGF. Big green friut；GWF. Green white fruit；WF. White fruit；WRF. White red fruit；YRF. Yellow red fruit；RF. Red fruit.Fig.1 SlCBL1 gene expression in tomato fruits of different development stages

圖2 植物表達載體pK7WG2D-SlCBL1構建過程Fig.2 Construction of plant expression vector pK7WG2D-SlCBL1

A. 侵染后的番茄葉片；B.不定芽；C.抗性植株；D.完整的轉基因番茄；E.愈傷組織熒光；F.花熒光；G.小綠果熒光；H.非轉基因果實和轉基因果實熒光對比圖3 番茄轉基因過程以及綠色熒光檢測A.Tomato leaf infection； B.Adventitious buds； C.Tomato resistance seedlings；D.Complete transgenic tomato；E.Callus fluorescence；F.Flower fluorescence；G.SGF fluorescence；H. Non-gmo fruit and transgenic fruits fluorescent contrastFig.3 The tomato genetically modified process and green fluorescence detection

2.4 轉基因番茄的SlCBL1基因功能分析

轉SlCBL1基因、轉空載體以及非轉基因的種子同時播種后，放置于相同環境條件下，觀察果實發育。結果發現轉SlCBL1基因的果實成熟更快(圖5)。通過大量果實的觀察發現轉SlCBL1基因的果實能夠比轉空載和非轉基因對照平均提前成熟3～5 d，該結果更進一步說明SlCBL1基因在番茄果實成熟中是起作用的，能夠促進番茄果實成熟。

分析了3個不同發育時期果實中影響番茄果實成熟的22 個相關基因表達量變化，結果表明SlCBL1基因超表達對果實成熟相關基因都有不同程度的影響。其中影響最大的是對色素合成相關基因SlCHS1、SlCHI、SlF3H、SlPSY1，與對照相比，這些基因的表達量都有5～10倍或者超過10倍的上調(圖6)。這說明SlCBL1基因促進番茄果實成熟首先是通過調控色素代謝相關基因完成的。除此以外，影響最明顯的還有與番茄成熟相關的一些轉錄因子也受到強烈上調，其中SlWRKY33A和SlERF6上調也超過10倍以上。綜合以上結果可以初步說明SlCBL1基因超表達會影響色素代謝基因、乙烯路徑基因以及和成熟相關轉錄因子的表達，進而影響果實成熟。

M. DNA marker； S1～S10. 10個不同轉基因株系；N-CK. 非轉基因；CK. 空載對照. 圖4 轉基因番茄PCR和熒光定量PCR檢測M. DNA marker；S1-S10. 10 different gm strains；N-CK:Non-genetically modified；CK.Empty vector controlFig.4 Transgenic tomato PCR and fluorescence quantitative PCR detection

SGF.小綠果；MGF.中綠果；BGF.大綠果；GWF.綠白果；WF.白果；WRF.白轉紅；YRF.黃紅果；RF. 全紅果.圖中的轉SlCBL1基因植株為株系S3圖5 番茄的成熟過程對比SGF. Small green friut；MGF. Middle green friut；BGF. Big green friut；GWF. Green white fruit；WF. White fruit；WRF. White red fruit；YRF. Yellow red fruit；RF. Red fruit. SlCBL1 transgenic plant in the figure is strain S3Fig.5 Mature process of tomato

MGF.中綠果；WF.白果；RF. 全紅果.圖中的轉SlCBL1基因植株為株系S3圖6 轉SlCBL1基因番茄果實成熟相關基因分析MGF. Middle Green Friut；WF. White Fruit；RF. Red Fruit. SlCBL1 transgenic plant In the figure is strain S3Fig.6 The ripe related gene analysis of tomato genetically modified with SlCBL1 gene

3 討 論

番茄作為一種重要的園藝作物，其品質形成及成熟調控研究是近年來研究的重要問題之一。多年來，科研工作者圍繞番茄果實發育及成熟機理開展了很多研究，但這些研究主要集中在激素包括乙烯、茉莉酸、水楊酸，一些多胺類物質以及相關酶類[16-19]，相關研究也多針對果實發育及成熟過程中某些生理、生化過程變化的探討上，而對果實發育及成熟調控的分子基礎了解甚少。

目前已經從番茄中分離鑒定出13個CBL基因，并對它們的基因組分布、分子特征、系統進化以及順式元件進行了分析，為研究番茄CBL的功能提供線索[31]。而盡管相關的研究很多，但是目前幾乎所有關于CBL基因的研究都是研究其在抗逆中的作用，很少有研究其在果實發育及成熟調控中的作用。本研究首先分析了番茄果實發育不同階段SlCBL1基因的表達量差異，結果表明，番茄在不同的發育階段，表達量差異很大，說明在番茄果實成熟過程中，SlCBL1基因是起作用的。為了進一步驗證SlCBL1基因在果實成熟中的作用，通過穩定轉基因，將SlCBL1基因成功轉入番茄品種‘Micro Tom’。對轉基因番茄和對照的果實發育進程觀察，初步確定SlCBL1基因超表達能夠促進番茄果實發育成熟。對番茄成熟相關的22 個基因表達量分析結果也表明。SlCBL1基因超表達會影響包括色素代謝基因、成熟軟化相關基因、乙烯路徑基因以及與成熟相關轉錄因子的表達量變化。很多基因受到強烈的調控，因涉及基因較多，詳細機理還有待進一步研究。

綜上所述，SlCBL1在番茄中的功能除了操縱植物的抗逆性，還能夠調控植物的生長和發育。番茄果實中SlCBL1基因超表達可以調控果實成熟相關基因的表達，因而操縱番茄果實的發育和成熟進程。雖然目前本研究不能夠詳細解釋相關機理，但是對深入解析番茄果實發育及成熟調控的分子機理具有參考價值，同時對CBL基因家族的研究提供了一條新的思路。

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(編輯:宋亞珍)

Molecular Mechanism ofSlCBL1 Regulation during Tomato Fruit Development

WANG Yuanhua1,2,JIA Sizhen1,2, YAN Zhiming1,2, FENG Yingna1,2

(1 Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry, Zhenjiang，Jiangsu 212400，China; 2 Jiangsu Engineering and Technology Center for Modern Horticulture，Zhenjiang，Jiangsu 212400，China)

With tomato (SolanumlycopersicumL.) variety ‘Micro Tom’ as test materials, we cloned the tomato Calcineurin B-Like gene (SlCBL1) from ‘Micro Tom’ fruitand constructed inplant expression vector with e-GFP report gene. Then we analyzed the relationship betweenSlCBL1 gene over-expression and tomato fruit development. The results show that: (1) compared with non-transgenic plants and empty vector plant, over-expressionSlCBL1 can promote fruit mature and made tomato fruit mature for 3 to 5 days in advance. (2) The expression of tomato fruit development related genes also regulated in different degrees. Including tomatoes mature in the process of pigment synthesis genes, the path of ethylene and ripe related transcription factors have been strongly regulated, and the expression level raised about 5 to 10 times compared with control. Results show thatSlCBL1 gene can promote the fruit development, and by influencing the pigment synthesis genes and ripe related transcription factors to control tomato fruit mature.

tomato‘Micro Tom’；SlCBL1 gene；fruit development

1000-4025(2016)11-2173-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2173

2016-08-19;修改稿收到日期:2016-10-31

江蘇農林職業技術學院院級項目(2014kj15)；江蘇高校品牌專業建設工程資助項目(PPZY2015B173)；江蘇省自然科學基金(BK20160567)

王媛花(1981-)女，博士，講師，主要從事園藝植物分子生物學研究。E-mail:wangyuanhua0511@163.com

Q785;Q786

A