苯酚對斑馬魚的抗氧化酶活性及運動行為的影響

孫中訓(xùn)，杜娟娟，周紹輝，李 梅，逯南南，宋武昌

苯酚對斑馬魚的抗氧化酶活性及運動行為的影響

孫中訓(xùn)1，杜娟娟1，周紹輝1，李 梅1，逯南南2，宋武昌2

(1.山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東 濟南 250101；2.山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測中心，山東 濟南 250021)

為了考察斑馬魚對苯酚類污染物的生物反應(yīng)，以斑馬魚作為模式生物，采用半靜態(tài)實驗法研究了苯酚對斑馬魚的急性毒性、抗氧化酶活性及運動行為的影響。結(jié)果表明：苯酚對斑馬魚的24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分別為24.247 mg·L-1、18.548 mg·L-1、15.511 mg·L-1、13.554 mg·L-1；斑馬魚鰓中的Na+K+-ATP酶活性和肝臟中的SOD活性的變化反映出苯酚對斑馬魚的鰓和肝臟具有損傷作用，斑馬魚體內(nèi)酶對苯酚污染敏感，可以將其作為苯酚污染的有效生物標志物；斑馬魚的運動行為變化與苯酚濃度及染毒時間明顯相關(guān)，且呈規(guī)律性，可以通過監(jiān)測斑馬魚的運動行為變化實現(xiàn)苯酚污染的在線預(yù)警。

斑馬魚；苯酚；急性毒性；抗氧化酶活性；運動行為；生物在線預(yù)警

苯酚是一類中等毒性的有機化學(xué)污染物，在工業(yè)生產(chǎn)過程中可能會隨工業(yè)廢水、地表徑流進入水環(huán)境，進而污染水質(zhì)。當苯酚進入生物體時會發(fā)生一系列生物反應(yīng)[1]，并通過生物鏈積累對人體和水生生物產(chǎn)生不同程度的急性或慢性毒性效應(yīng)[2-6]。研究表明，長期飲用被苯酚污染的飲用水可能會使人出現(xiàn)頭暈、出疫、貧血等不良癥狀，嚴重時還損傷肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7-8]。苯酚污染廢水一旦進入水環(huán)境會對魚類等水生生物產(chǎn)生毒害作用，損傷鰓、肝臟等組織器官，破壞呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的正常功能，導(dǎo)致魚類等水生生物窒息死亡[1]。因此，亟需深入開展以水生生物為研究對象的水質(zhì)生物預(yù)警技術(shù)研究，對水質(zhì)進行實時在線監(jiān)測，實現(xiàn)對突發(fā)性苯酚污染的早期預(yù)報和及時應(yīng)對。

目前，基于斑馬魚行為變化的生物在線監(jiān)測技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于水質(zhì)安全在線監(jiān)測系統(tǒng)，借助計算機和生物傳感器等技術(shù)手段將斑馬魚行為學(xué)指標轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的信息和數(shù)據(jù)[1]，實時監(jiān)測水質(zhì)安全。作者通過苯酚對斑馬魚的急性毒性、抗氧化酶活性、運動行為的影響，考察了苯酚對斑馬魚的毒性效應(yīng)及在線預(yù)警技術(shù)對突發(fā)性苯酚污染的預(yù)警效果，針對斑馬魚運動行為變化規(guī)律進行定性、定量分析[5，9]，擬為在線監(jiān)測苯酚污染提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和分析方法。

1 實驗

1.1 受試生物

斑馬魚，購自國家斑馬魚資源中心，在實驗室飼養(yǎng)馴化2周，死亡率小于5%。飼養(yǎng)用水為充分曝氣去氯的自來水，水溫為(25±1)℃，pH值為7.2～7.6，水中溶解氧為4 mg·L-1以上，光暗比為10 h∶14 h，每天投喂1次。實驗前24 h停止喂食，隨機選取健康活潑、個體差異不大的魚進行實驗。

1.2 藥品、試劑與儀器

苯酚：用標準稀釋水稀釋母液得到不同濃度苯酚溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。標準稀釋水：使用前測定其pH值、溶解氧量，保證pH值穩(wěn)定在7.8左右、溶解氧量≥8 mg·L-1，否則用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，用曝氣處理調(diào)節(jié)溶解氧量。

蔗糖；三羥甲基氨基甲烷(Tris)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)；酶測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

UV1800型紫外可見分光光度計；TD5A-WS型高速離心機；EMax Plus型多功能酶標儀；HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋；Eppendorf(100～1 000 μL)微量移液槍。

1.3 方法

1.3.1 急性毒性實驗

96 h急性毒性實驗參照GB/T 13267-91《水質(zhì)物質(zhì)對淡水魚(斑馬魚)急性致死毒性的測定》進行。采用靜態(tài)置換法每天更新一半溶液[9-10]，保證溶液濃度不變，并記錄更換前后染毒液的pH值、溫度、溶解氧，周期為96 h。通過預(yù)實驗確定斑馬魚最高全存活濃度和最低全致死濃度，在這2個濃度間選定6個濃度作為實驗濃度梯度，分別是5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1，同時設(shè)空白對照組，每組設(shè)置3個平行，均隨機放入10條大小相近的斑馬魚成魚，魚的平均體長為(3±0.2)cm。觀察記錄24 h、48 h、72 h、96 h死魚數(shù)及中毒癥狀，并及時撈出死魚和代謝產(chǎn)物。用SPSS19.0軟件計算半致死濃度(LC50)和95%可信度。

1.3.2 Na+K+-ATP酶活性和SOD活性的測定

根據(jù)急性毒性實驗結(jié)果確定染毒藥劑的濃度梯度。以48 h半致死濃度(48 h LC50)為1個染毒單位(TU)，濃度梯度設(shè)定為染毒單位的0.01倍、0.05倍、0.1倍、0.5倍、1倍，即0.18 mg·L-1、0.9 mg·L-1、1.8 mg·L-1、9 mg·L-1、18 mg·L-1，同時設(shè)空白對照組。每組設(shè)3個平行，各放斑馬魚10條。實驗水溫為(25±1)℃，pH值為7.2～7.6，光暗比為10 h∶14 h，每24 h更新一半測試溶液，以維持原設(shè)計的溶液濃度及溶解氧等水質(zhì)標準，實驗期間不喂食。

實驗開始后分別于0 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h從各組隨機取1條斑馬魚，迅速解剖，取其鰓、肝臟至冰冷的0.9%生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙拭干，準確稱量魚體的濕質(zhì)量。取待測組織0.2 g，加入1.8 mL勻漿介質(zhì)(pH值7.4，0.01 mol·L-1Tris-HCl，0.01 mol·L-1蔗糖，0.9%生理鹽水，0.0001 mol·L-1EDTA-2Na)中，冰浴下充分研磨制成1%的組織勻漿。4 ℃、4 000 r·min-1離心15 min，取上清液于-20 ℃冷藏，為了不影響酶活性盡量避免反復(fù)凍融組織勻漿。Na+K+-ATP酶活性和SOD活性的測定參照試劑盒說明書進行。

Na+K+-ATP酶活性定義：將每小時每毫克組織蛋白中 ATP 酶分解 ATP 產(chǎn)生 1 μmol無機磷的量定義為一個Na+K+-ATP酶活力單位，單位為U·(mg prot)-1。

SOD活性定義：將每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量定義為一個SOD酶活力單位，單位為U·mg-1。

1.3.3 斑馬魚運動行為監(jiān)測

采用水質(zhì)毒性在線生物監(jiān)測儀(RTB，深圳水務(wù)集團)定量監(jiān)測苯酚脅迫下斑馬魚的運動行為變化。測試箱(400 mm×75 mm×300 mm)內(nèi)放置5條斑馬魚，前置CCD 攝像頭，實時跟蹤記錄每條魚的運動行為變化，如圖1所示。通過運動行為解析軟件計算5條魚的運動行為參數(shù)(游動速度)[10]。

圖1 斑馬魚運動行為監(jiān)測裝置

采用半靜態(tài)式流水實驗(流速1 L·h-1)研究苯酚污染水體中斑馬魚的運動行為變化。保持水溫(25±1)℃，為消除容器變化對斑馬魚運動行為的影響，實驗前通入曝氣去氯的自來水，讓魚在其中適應(yīng)24 h。盡量減少人為、噪音等非水質(zhì)因素的干擾，投加染料觀察測試箱內(nèi)水力流態(tài)，經(jīng)水泵提升水由測試箱底部進入，由下至上均勻擴散至頂端出水口。實驗過程中不喂食，空白對照組和實驗組不能有魚死亡。從染毒溶液進入開始，連續(xù)監(jiān)測48 h。

參照斑馬魚48 h LC50，苯酚的6個濃度梯度分別為0.18 mg·L-1、0.9 mg·L-1、1.8 mg·L-1、9 mg·L-1、18 mg·L-1、36 mg·L-1，同時設(shè)置空白對照，研究斑馬魚在不同濃度苯酚脅迫下的運動行為變化。每組數(shù)據(jù)為5條魚的平均數(shù)據(jù)，每個濃度組設(shè)3個平行，取平均值。設(shè)置染毒溶液污染物濃度為配制時的濃度，而不是水槽中污染物的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行計算處理，結(jié)果以均值±標準差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 急性毒性結(jié)果

實驗發(fā)現(xiàn)，空白對照組中斑馬魚的游動、呼吸、對外界刺激反應(yīng)等行為無明顯變化。而在苯酚脅迫下，斑馬魚先出現(xiàn)呼吸急促、游動加快等現(xiàn)象，隨后表現(xiàn)出呼吸放緩、靜止不動、體表條紋消失等中毒癥狀，且苯酚濃度越大，中毒癥狀出現(xiàn)的時間越早。高濃度組(40 mg·L-1和50 mg·L-1)染毒30 min后，部分斑馬魚即表現(xiàn)出劇烈的異常反應(yīng)，在燒杯中急速游動，上下翻滾，四處亂竄，魚體失去平衡，擺尾擺鰭頻率明顯加快，4 h后即有部分斑馬魚死亡，漂浮于水面。苯酚對斑馬魚的急性毒性實驗結(jié)果如表1和表2所示。

從表1可以看出，隨著苯酚濃度的升高，斑馬魚的平均死亡率升高。由表2可以看出，苯酚對斑馬魚的24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分別為24.247 mg·L-1、18.548 mg·L-1、15.511 mg·L-1、13.554 mg·L-1，24 h LC50約為96 h LC50的2倍。說明苯酚對斑馬魚的毒性作用隨染毒時間延長而增強，二者呈明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系。

表1 苯酚對斑馬魚的急性毒性實驗結(jié)果

Tab.1 Results of acute toxicity of phenol toBrachydaniorerio

苯酚濃度mg·L-1染毒不同時間的平均死亡率/%24h48h72h96h空白對照00005006.66.6100132626205366808630869310010040931001001005096100100100

表2 苯酚對斑馬魚的24 h、48 h、72 h、96 h的LC50

Tab.2 The LC50 value(24 h,48 h,72 h,96 h) of phenol to Brachydaniorerio

2.2 苯酚對斑馬魚Na+K+-ATP酶和SOD活性的影響

2.2.1 苯酚對斑馬魚鰓Na+K+-ATP酶活性的影響(圖2)

a～f，苯酚濃度(mg·L-1)：0,0.18,0.9,1.8,9,18

從圖2可以看出，不同苯酚濃度下，斑馬魚鰓Na+K+-ATP酶活性隨染毒時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。24 h時，除18 mg·L-1染毒組外，其余各組Na+K+-ATP酶活性均受到明顯的抑制；48 h時，0.18 mg·L-1染毒組Na+K+-ATP酶活性被顯著抑制，18 mg·L-1染毒組Na+K+-ATP酶活性受到顯著誘導(dǎo)，其余各組Na+K+-ATP酶活性與對照組相比無顯著差異，但活性與24 h相比有所升高；72 h時，除0.18 mg·L-1染毒組外，其余各組Na+K+-ATP酶活性均受到明顯誘導(dǎo)，且在各濃度組中達到最大值；96 h時，各染毒組Na+K+-ATP酶活性相較于72 h時有所降低。除18 mg·L-1染毒組在整個96 h實驗周期內(nèi)Na+K+-ATP酶活性一直呈誘導(dǎo)作用外，其余各組Na+K+-ATP酶活性都首先被抑制，然后先升高后降低，并在72 h達到最大值。但是苯酚濃度不同，Na+K+-ATP酶活性變化趨勢仍存在一定差異。低濃度(0.18 mg·L-1、0.9 mg·L-1)苯酚染毒6 h時，斑馬魚感知環(huán)境變化，苯酚對Na+K+-ATP酶活性產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，與對照組相比Na+K+-ATP酶活性升高了10%、18%，呈現(xiàn)“毒性興奮效應(yīng)”；隨著染毒時間的延長，苯酚對Na+K+-ATP酶活性誘導(dǎo)作用開始減弱，至24 h時出現(xiàn)明顯抑制作用；持續(xù)染毒過程中，苯酚對Na+K+-ATP酶活性抑制作用減弱，Na+K+-ATP酶活性呈現(xiàn)上升趨勢，72 h時Na+K+-ATP酶活性達到峰值；但隨著染毒時間的繼續(xù)延長，苯酚對斑馬魚機體產(chǎn)生不可逆的毒性損傷作用，Na+K+-ATP酶活性又開始呈現(xiàn)下降趨勢。

2.2.2 苯酚對斑馬魚肝臟SOD活性的影響(圖3)

a～f，苯酚濃度(mg·L-1)：0,0.18,0.9,1.8,9,18

從圖3可以看出，斑馬魚肝臟SOD活性隨苯酚染毒時間不同呈現(xiàn)出顯著差異性。染毒初期，苯酚對SOD活性表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)；隨著染毒時間的延長，誘導(dǎo)作用逐漸減弱，甚至產(chǎn)生抑制作用。實驗發(fā)現(xiàn)，苯酚染毒后造成斑馬魚體內(nèi)酶的過氧化脅迫，短期內(nèi)體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，造成活性氧防御能力的改變，SOD活性對污染物脅迫十分敏感，其活性變化可間接反映水質(zhì)污染情況[11]。SOD活性與苯酚濃度、染毒時間呈明顯的效應(yīng)關(guān)系，苯酚濃度、染毒時間不同，斑馬魚肝臟SOD活性表現(xiàn)出不同程度的抑制或誘導(dǎo)作用。

2.3 斑馬魚的運動行為變化情況(圖4)

圖4 不同濃度苯酚脅迫下斑馬魚的游動速度

從圖4可以看出，空白對照組(□標記)斑馬魚的游動速度在正常范圍內(nèi)變化，變化幅度較小；而苯酚脅迫下，斑馬魚在水箱中的位置分布與染毒前有所不同，游動速度發(fā)生明顯變化，隨染毒濃度和染毒時間不同，游動速度差異顯著。(1)低濃度(0.18 mg·L-1、0.9 mg·L-1)苯酚脅迫下，斑馬魚游動速度呈先加快后恢復(fù)的變化趨勢。斑馬魚在染毒后2 h感知污染物刺激，表現(xiàn)出“回避行為”，游動速度有加快趨勢；染毒4～5 h后游動速度開始低于對照組；隨著染毒時間的繼續(xù)延長，斑馬魚游動速度逐漸減慢，染毒10 h后游動速度趨于穩(wěn)定。(2)中等濃度(1.8 mg·L-1、9 mg·L-1)苯酚脅迫下，斑馬魚的游動速度較低濃度組明顯減慢，達到峰值的時間縮短了1 h左右，且峰值增長率也明顯升高。由此可知，苯酚濃度增大，毒性增大，對斑馬魚游動行為的抑制作用也隨之增強，隨染毒時間延長，其游動速度減慢，且無法恢復(fù)至正常水平。(3)高濃度(18 mg·L-1、36 mg·L-1)苯酚脅迫下，斑馬魚游動速度變化趨勢與中等濃度組相似。與其它濃度組相比，高濃度組斑馬魚的游動速度變化明顯，波動劇烈，且短時間染毒斑馬魚的游動速度就高于對照組，達到峰值的時間也縮短了1～2 h，高濃度苯酚染毒對斑馬魚游動速度抑制作用明顯增強。

2.4 討論

(1)正常水體中斑馬魚的游動速度保持相對穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，短時間苯酚脅迫下，根據(jù)苯酚濃度不同，斑馬魚在環(huán)境壓力作用下，游動速度均是先加快后恢復(fù)再減慢，只是發(fā)生變化的時間和變化幅度有所差異。低濃度苯酚脅迫下，斑馬魚運動行為參數(shù)增長率較低，但是持續(xù)時間長；高濃度苯酚脅迫下，斑馬魚運動行為參數(shù)增長率較高，行為參數(shù)發(fā)生劇烈變化，持續(xù)一段時間又急劇降低。

(2)與對照組相比，苯酚濃度越大，斑馬魚的游動速度減小趨勢越明顯，與對照組的差值也越大，說明斑馬魚的游動速度與苯酚濃度、染毒時間都呈明顯的效應(yīng)關(guān)系，但是由于斑馬魚個體差異，游動速度達到的最大值與苯酚濃度沒有較好的相關(guān)性。

(3)染毒后短時間內(nèi)魚的游動速度加快，此為水生生物對環(huán)境壓力所表現(xiàn)的“回避行為”，是魚類感知到污染物后的第一反應(yīng)，其表現(xiàn)形式和維持時間長短受污染物的種類及濃度的影響，“回避行為”也被應(yīng)用于水質(zhì)監(jiān)測和預(yù)警[12-13]。

(4)整個實驗過程中，斑馬魚感知環(huán)境壓力表現(xiàn)出了明顯的行為調(diào)節(jié)，游動速度在1～6 h內(nèi)高于對照組并達到峰值，濃度越大，達到峰值的時間越短，說明苯酚脅迫下斑馬魚游動速度比較敏感，可以選取游動速度作為在線監(jiān)測苯酚污染后的行為異常指標。

3 結(jié)論

采用半靜態(tài)實驗法，研究了苯酚對斑馬魚的急性毒性、抗氧化酶活性及運動行為的影響。結(jié)果表明：苯酚對斑馬魚的24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分別為24.247 mg·L-1、18.548 mg·L-1、15.511 mg·L-1、13.554 mg·L-1，苯酚對斑馬魚毒性呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系、時間-效應(yīng)關(guān)系；苯酚脅迫下，斑馬魚鰓中的Na+K+-ATP酶活性和肝臟中的SOD活性的變化反映出苯酚對斑馬魚的鰓和肝臟具有損傷作用，酶活性與苯酚的染毒濃度和染毒時間呈一定的相關(guān)性；斑馬魚的運動行為變化與苯酚濃度及染毒時間明顯相關(guān)，且呈規(guī)律性，可以通過監(jiān)測斑馬魚的運動行為變化實現(xiàn)苯酚突發(fā)污染的在線預(yù)警。

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Effects of Phenol on Antioxidant Enzyme Activity and Movement Behavior of Brachydaniorerio

SUN Zhong-xun1,DU Juan-juan1,ZHOU Shao-hui1,LI Mei1,LU Nan-nan2,SONG Wu-chang2

(1.SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering,ShandongJianzhuUniversity,Jinan250101,China;2.ShandongProvinceCityWaterSupplyandDrainageWaterQualityMonitoringCenter,Jinan250021,China)

To investigate the biological response ofBrachydaniorerioexposed to phenol pollutants,usingBrachydaniorerioas a model organism,the effects of phenol on acute toxicity,antioxidant enzyme activity,and movement behavior ofBrachydanioreriowere studied by a semi-static test.The results showed that,the LC50values(24 h,48 h,72 h,96 h) of phenol toBrachydanioreriowere 24.247 mg·L-1,18.548 mg·L-1,15.511 mg·L-1and 13.554 mg·L-1,respectively.The variation of Na+K+-ATPase activity and SOD activity could reflect the damage of phenol to gill and liver ofBrachydaniorerio.Enzyme inBrachydanioreriowas sensitive to phenol pollutants and could be a valid biomarker of phenol pollutants.Movement behavior changes ofBrachydanioreriocorrelated with stress concentration and time of phenol,and presented regularity.So,online monitoring technology based on the movement behavior changes ofBrachydanioreriois an effective way to realize online early warning of water quality.

Brachydaniorerio;phenol;acute toxicity;antioxidant enzyme activity;movement behavior;biological online early warning

直飲水科技惠民示范工程(2013GS370202)

2016-07-26

孫中訓(xùn)(1989-)，男，山東棗莊人，碩士，研究方向：給水處理技術(shù)，E-mail:sunzhongxun89@126.com；通訊作者：李梅，博士，教授，E-mail:limei@sdjzu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.12.014

孫中訓(xùn)，杜娟娟，周紹輝，等.苯酚對斑馬魚的抗氧化酶活性及運動行為的影響[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(12)：63-67.

X 832

A

1672-5425(2016)12-0063-05